半巢式甲基化特异性聚合酶链反应对肿瘤细胞株p15基因甲基化或缺失状态的检测
作者：林福安 叶宝国 沈建箴 周华蓉 傅海英 范丽萍
【摘要】 本研究分析多种恶性肿瘤细胞株的p15基因甲基化或缺失状态，阐明p15基因甲基化或缺失在肿瘤发生中的作用。运用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应（hemi?nested methylation specific polymerase chain reaction，hn?MSP）分析20种恶性肿瘤细胞株和正常人单个核细胞或细胞株的p15基因甲基化及缺失状态，并评价该方法的敏感性和特异性。结果表明：在所有的细胞中， Molt?4、Raji、KG1、CA46、SW480、NCE、SMMC?7221、NCI?H446细胞为部分甲基化，hn?MSP检测p15基因甲基化敏感性可达到1×10-5。正常人单个核细胞、HL?60、HeLa、HepG2、293、SGC7901、U266、CEM细胞则为p15非甲基化，而K562、NB4、GMC、Jurkat似乎显现p15基因缺失或突变。结论:p15基因甲基化或缺失在多种肿瘤，特别在恶性血液病中有较高的发生率，且对疾病的进展及预后有密切的关系，hn?MSP具有较高的敏感性和特异性，值得在临床推广应用。
【关键词】 p15INK4B；基因甲基化；基因缺失；hn?MSP
Detection of p15 Gene Methylation or Deletion Status in Different Malignant Cell Lines by Using Hemi?nested Methylation Specific Poly?merase Chain Reaction
Abstract This study was aimed to investigate the methylation or deletion status of p15 gene in different malignant cell lines，and further to clarify their roles in the development and progression of malignant tumors. Hemi?nested methylation specific polymerase chain reaction (hn?MSP) was adopted to analyze p15 gene methylation or deletion status in 20 malignant tumor cell lines and mononuclear cells or normal cell lines in healthy people, as well as to evaluate its sensitivity and specificity. The results showed that among all of the cell lines, Molt?4,KG1,NCE,Raji,SMMC?7221,CA46,SW480 and NCI?H446 were partial methylated with CDKN2B gene，and its sensitivity of detection of p15 gene methylation was up to 1.0×10-5, also it had great specificity. Peripheral blood mononuclear cell(MNCs)from healthy volunteer,HL?60,HepG2,293,HeLa,SGC7901,U266 and CEM were unmethylated; and K562,NB4,GMC,Jurkat seemed to have deletion or mutation of p15 gene. It is concluded that the incidence of p15 gene methylation or deletion in many tumours, especially malignant hematopathy, is frequent, they correlate with disease progression and prognosis. Hn?MSP is highly sensitive and specific in analyzing p15 gene methylation, deserving in clinical application.
Key words p15INK4B；gene methylation；gene deletion；hemi?nested MSP
J Exp Hematol 2007; 15(2):382-386
表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，在肿瘤发生发展中具有重要的作用。DNA甲基化被认为是肿瘤形成的重要机制之一，抑癌基因可因高度甲基化而失活，这种基因沉默调控与体细胞突变共同促进了肿瘤的发展。目前检测基因甲基化状态的方法有很多种［1-3］，概括起来可分为3组：①应用甲基化敏感的限制性内切酶方法。这种方法有可能因为酶切反应的不完全而产生假阳性；另外由于受限制性内切酶识别位点的限制，仅能对部分位点的甲基化状态进行检测。②通过亚硫酸氢钠等化学试剂对非甲基化的胞嘧啶进行修饰为基础的反应， 主要为 PCR。 ③ 利用某种蛋白对甲基化DNA和非甲基化DNA亲和力的不同。本课题组通过优化p15基因甲基化特异性聚合酶链式反应（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）的方法，设计了p15基因半巢式MSP引物对多种细胞株的p15基因甲基化状态进行筛选，同时也间接地分析了其p15基因第1外显子是否存在缺失。
主要试剂和仪器
19种细胞株（10种恶性血液病细胞株和9种其他细胞株）均由福建医科大学附属协和血液病研究所及其他研究所提供。RPMI 1640培养液为Gibco公司产品,胎牛血清为浙江杭州四季青产品，蛋白酶K、RNA酶、DNA修饰药物亚硫酸氢钠，氢醌（对苯二酚）等试剂购自Sigma公司，酚?氯仿DNA抽提液为上海生工生物工程公司产品，Wizard DNA树酯纯化柱均为Promega公司产品， DNA Marker 1购自厦门泰京生物有限公司，普通Taq酶为TaKaRa公司产品，半巢氏引物由上海生工生物工程公司合成。所用仪器为:37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱（Heal Force）、2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems,Version 2.08）、紫外分光光度仪(美国贝克曼公司DU?640产品)、凝胶成像仪(BIO?RAD产品，Gel Doc 1000)。
细胞培养
各种细胞株经复苏后置于含10％胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，隔天传代，保持实验用细胞均处在对数生长期。
基因组DNA的提取、硫化修饰以及纯化
收集1×106处于对数生长期的细胞，常规酚?氯仿提取细胞基因组DNA，用去离子水溶解后于-20℃保存。取1-2 μg DNA溶于去离子水中至25 μl，加入0.4 mol/L NaOH(终浓度为0. 2 mol/L) 25 μl,置于37℃变性10分钟后，加入10 mmol/L 氢醌30 μl 和3 mol/L亚硫酸氢钠(pH= 5)520 μl混匀加液体石蜡20 μl在50℃孵育16小时。
利用Wizard DNA Clean?up纯化试剂盒过柱纯化修饰后的DNA，加入新鲜配置的0.6 mol/L的NaOH至终浓度为0.3 mol/L，37℃放置10分钟终止反应，无水乙醇沉淀并重新溶解于30 μl去离子水，-20℃保存备用。
各种细胞株的p15基因甲基化或缺失状态半巢式MSP检测
p15基因的半巢式MSP 用于半巢式MSP法扩增的p15引物序列是根据从NCBI获得的CDKN2B序列（NM_078487）在Methprimer网站上自行设计［4］（表1）。25 μl p15MSP反应体系包括：修饰后DNA 50 ng，DNA Taq酶1 U，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl，10×Buffer（含MgCl2）2.5 μl，25 pmol/L引物各0.2 μl。第1轮PCR用外侧引物，反应条件为94℃ 10分钟，然后于94、54℃、72℃各30秒，循环30次，最后于72℃延伸7分钟。把第1轮PCR产物稀释50倍，取2 μl进行第2轮的扩增，引物为p15 M2上游和p15 M下游，同样条件扩增25个循环。P15USP反应条件基本同p15MSP，仅把退火温度改为56℃。实验根据上设Molt?4为阳性对照，正常人单个核细胞为阴性对照，NB4为缺失对照以及去离子水为空白对照。
hn?MSP 产物（阳性对照和阴性对照）T?A 克隆及DNA测序分析 取hn?MSP产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，切出所需克隆的条带，用Wizard PCR Preps DNA纯化试剂盒（上海博亚生公司产品）进行纯化，采用TaKaRa公司PMD?18?T载体试剂盒进行连接，然后转化并涂布至Amp板，37℃倒置培养过夜，至克隆长出；根据交叉反应原理，进行蓝白筛选，选取阳性克隆测序，以进一步p15基因的甲基化状态。
半巢氏MSP对p15基因甲基化状态检测的敏感性测定
将阳性对照细胞株Molt?4和阴性对照细胞株（正常人单个核细胞）按1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105混合提取基因组DNA后硫化、纯化等进行第1轮MSP，对于1∶103，1∶104，1∶105组取第1轮产物1.0 μl无稀释直接进行下一轮MSP，其他条件同p15 MSP。
结 果
各种细胞株的p15基因甲基化或缺失状态
对于p15基因完全甲基化阳性的标本，经2次扩增后可扩增出特异性p15M条带，而p15U基因扩增结果为阴性；反之，对于p15基因甲基化阴性的标本，经2次扩增后可扩出特异性p15U条带，而p15M基因扩增结果为阴性；如果部分甲基化，则p15M和p15U条带同时出现；如果所扩增片段缺失，则p15M和p15U条带均无出现。故而可根据标本的p15M和p15U同时扩增的情况判断该标本的甲基化状态。
从凝胶电泳图上看，MSP的结果出现了3种情况，即部分甲基化、非甲基化及缺失或突变。在20种细胞中，Molt?4、Raji、KG1、CA46、SW480、NCE、SMMC?7221、NCI?H446细胞为部分甲基化，正常人单个核细胞、HL?60、HeLa、HepG2、293、SGC7901、CEM、U266细胞则为p15基因非甲基化，而K562、NB4、GMC、Jurkat细胞似乎发生p15基因缺失或突变（图1），所有结果均重复2次以上，详见表2。
p15MSP、p15USP产物测序结果
从阳性对照（Molt?4）测序结果看，其CpG岛中的C大部分未转化为T，而非CpG岛中的C则都转化为T；相反，阴性对照（MNC）则C全转换成T（图2）。
p15MSP具有高敏感性
将阳性对照Molt?4细胞与和阴性对照正常人单个核细胞细胞按1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105混合后进行p15M的MSP测定,至1∶105混合后进行p15M的MSP测定仍可见阳性结果,说明本方法灵敏度高,至少在1∶105个细胞时仍可测定出阳性结果(图3)。
讨 论
恶性肿瘤细胞的本质特征之一是细胞具有无限增殖的潜能。正常有核细胞的增殖和分化是通过细胞周期来实现的，每个细胞周期由G1期、S期、G2期及M期组成。细胞周期的正常运行主要依靠细胞周期调控系统来完成，其中最重要的是以细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）为中心的Cyclins?CDK?CKI系统。p15基因表达的产物P15蛋白作为INK家族的重要成员，在细胞周期调控中发挥着重要的作用。在多种恶性肿瘤包括恶性血液病和实体瘤中，p15基因发生异常的主要途径是基因缺失和基因异常甲基化［5］。当p15基因5′ 端CpG岛发生异常甲基化或缺失时，基因转录失活，表达封闭，不能发挥细胞周期负调控作用，从而导致肿瘤细胞的恶性增殖。对恶性肿瘤及恶性血液病细胞p15基因的缺失、甲基化及其作用机制的研究结果，为临床上肿瘤的诊断、药物与基因以及预后评定等提供了理论依据。p15基因甲基化在恶性血液病发生过程中有较高的发生率，Herman等［6］发现，p15基因在急性白血病中总的甲基化率达75%。郭秀枝、范洪涛等［7，8］发现，p15INK4b基因启动子区的甲基化在急性髓系白血病中的发生率高达83.9％，多发性骨髓瘤中的发生率为70.8％，而慢性粒细胞白血病的发生似乎与p15基因的甲基化无关。
目前关于基因甲基化的检测有很多方法。甲基化的检测最早采用特异性甲基化酶切加Southern blot法，此法虽可定量，但需有特异性酶切位点，DNA需要量大，且接触放射性同位素，所以后来改进为酶切加PCR法，此法相比前法较快速、简便、敏感，无需接触同位素。但是，这种方法同Southern blot一样只能检测甲基化敏感的限制性酶切位点的CpG甲基化，且DNA必须酶切完全，否则亦出现假阳性。Herman等［6］于1996年了MSP方法以来，使该方法成为快速、灵敏地检测基因甲基化方法，并得到了广泛地应用。通过硫化修饰后，CpG岛中非甲基化的胞嘧啶经脱氨后转为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则对这种反应很弱，大部分无发生反应。这样通过设计特定的引物，包括甲基化和非甲基化引物就可以鉴别该基因的甲基化状态。甲基化引物序列来自经处理后的甲基化DNA链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;非甲基化引物来自经处理后的非甲基化DNA链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,与未经处理的DNA序列无互补配对。MSP法也有自身的局限性，其是以引物中所有CpG位点胞嘧啶均完全甲基化为前提设计的,而事实上甲基化的CpG岛中却并非每个CpG位点都完全甲基化,所以MSP法不能反映整个CpG岛甲基化状态的缺陷，所以设计不同引物对于同一细胞株同一基因可能会有不同的结果，如Molt?4在别的为完全甲基化，而本研究设计的引物则为部分甲基化。
由于经过碱变性和硫化脱氨等处理后2 μg的DNA仅剩不到200 ng，所以理想的方法是设计巢氏或半巢氏MSP进行甲基化的检测，这样既可增强特异性又可提高灵敏度。从目前的文献上看，p16基因已有人做过巢氏或半巢氏MSP，本课题组前期也有应用巢式p16MSP方法对恶性血液病细胞株进行了检测，证明了巢式MSP相对于普通的MSP有较高的敏感性和特异性［9］。对p15基因则尚未有人做过半巢氏MSP，大多是用普通MSP或用限制性酶切的方法检测。由前面的结果可知，本实验组设计的p15半巢氏引物在检测p15基因的甲基化状态时，阳性细胞株Molt?4为部分甲基化，同时见m和u条带，阴性对照正常人单个核细胞则为u条带，缺失型细胞株（NB4）及未经硫化处理的阳性对照基因组DNA都没有扩增出任何片段，说明该引物具有很好的特异性；该方法灵敏度高,至少在1∶105个细胞时仍可测定出阳性结果。
p15基因是目前已知大多数肿瘤细胞中特别是恶性血液病细胞中失活频率最高的肿瘤抑制基因之一，其启动子区甲基化在许多肿瘤中都是一个早发和频发事件。本课题研究表明，p15基因甲基化和缺失在肿瘤细胞株，特别是恶性血液病细胞株中发生率较高，hn?MSP方法具有较高的敏感性和特异性，且简便、快速，值得在临床上推广应用。
【文献】
1Shiraishi M, Oates AJ, Sekiya T. An overview of the analysis of DNA methylation in mammalian genomes. Biol Chem, 2002; 383: 893-906
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4Li LC, Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics, 2002; 18:1427-1431
5Leung WK, Yu J. Concurrent hypermethylation of multiple tumor related genes in gastric carcinoma and adjacent normal tissues. Cancer, 2001; 91: 2294-2301
6Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation?specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA, 1996; 93: 9821-9826
7范洪涛,郭秀枝,吴穷等. 多发性骨髓瘤中p15INK4B和p16INK4A基因高甲基化的检测. 实验血液学杂志 , 2000； 8：271-274
8郭秀枝,范洪涛,吴穷等. p15INK4B基因甲基化在急性粒细胞白血病和慢性粒细胞白血病中的研究. 中国实验血液学杂志, 2000； 8：266-270
9周华蓉,沈建箴,付海英等. 巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究.
