乳腺肿瘤克隆性检测方法的比较

             作者：于琦, 牛昀, 丁秀敏, 于泳, 史玉荣, 肖绪祺  

【关键词】  乳腺肿瘤； 克隆性检测； 聚合酶链反应； 普通PCR； 巢式PCR

　　0  引言
   
　　根据肿瘤的单克隆性，我们曾采用巢式PCR扩增DNA,用于研究乳腺癌癌前病变的早期诊断。我们将克隆性检测中所用聚合酶链反应的两种方法—普通PCR(G?PCR)和巢式PCR(N?PCR)的检测结果做一比较，以期找到更为简便、实用的方法。

　　1  资料与方法

　　1.1  临床资料
   
　　选择天津医科大学肿瘤乳腺病理室2000～2004年间存档的乳腺一般性增生（Usual ductal hyperplasia, UDH）和/外周型乳头状瘤（Peripapilloma, peri?PM）、不典型增生(Atypical ductal hyperplasia，ADH)和/peri?PM伴ADH及导管内癌 (Ductal carcinoma in situ, DCIS)石蜡包埋组织各30例，正常组织20例，均为女性，年龄19～72岁（中位49岁）。

　　1.2  研究方法

　　1.2.1  G?PCR反应  按朱少君等[1]报告的方法，提取DNA，并取1μg，按反应体系（HhaⅠ内切酶1μl、10×M缓冲液2μl、牛血清蛋白0.2μl加灭菌水至20μl） 37℃消化3h，65℃ 20min终止反应，冷却。取消化后的DNA10μl，加Premix Taq  25μl、引物AR1A和AR1B各2.2μl、加灭菌水至50μl反应体系（未经消化的DNA按以下公式换算：所加DNA（μl）=1/2消化时所需DNA（μl），再用灭菌水补足10μl）。按反应条件：97℃预变性7 min、94℃变性40s、56℃退火50s、72℃延长1min，共35个循环， 72℃延长15min。

　　1.2.2  N?PCR反应  取5μl G?PCR扩增产物,用灭菌水稀释至500μl,然后取10μl稀释的DNA加引物AR2A和AR2B（反应体系同G?PCR加至50μl）进行N?PCR反应(反应条件同G?PCR)。 AR1A：5’GAGGAGCTTTCCAGAATCTG 3’; AR1B：5’CATGGGCTTGGGGAGA 3’; AR2A：5’TCCAGAATCTGTTCCAGAGC 3’; AR2B：5’TGGGGAGAACCATCCTCACC 3’

　　1.2.3  琼脂糖凝胶电泳评价扩增效果，变性聚丙烯酰胺凝电泳，比较G?PCR和N?PCR的结果。

　　1.2.4  统计学分析采用配对四格表χ2检验。

　　2  结果

　　2.1  琼脂糖凝胶电泳显示G?PCR扩增条带清晰，与N?PCR相同，见图1。

　　2.2  变性聚丙烯酰胺凝胶电泳比较扩增情况
   
　　正常组织、UDH和/ peri?PM酶切前后无明显变化，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在200bp与300bpDNA泳动位置间显示2条带，说明具有AR位点的多态性，是多克隆的；导管内癌组酶切后两条带中的1条明显减弱或消失，显示出Ｘ染色体失活嵌合性的丢失，属于单克隆性增生；在ADH和/peri?PM伴ADH样本中，一部分显示多克隆的，而一部分是单克隆的。分别用N?PCR、G?PCR扩增产物进行以上实验过程，并逐例比较经N?PCR和G?PCR后在电泳图上显示的带型。两种方法均扩增成功的样本电泳结果相似，显示扩增效果是一致的,见图2。

　　2.3  各组样本G?PCR和N?PCR的扩增成功率比较  见表1。
   
　　M：Marker； 1：normal breast tissue； 2：Peri?PM；3和4： Peri?PM伴ADH；5和6：DCIS

　　图1  琼脂糖凝胶电泳图（略）

    M是Marker,每相邻两个泳道如1和2、3和4、5和6、7和8是同一样本酶切前后的带型

　　图2  经N?PCR和G?PCR扩增各组病变的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 （略）

　　3  讨论
   
　　最近10年,基于Ｘ染色体多态性为基础的克隆性分析技术已经逐步得到完善,已成为一种重要的分子病手段, 其中聚合酶链反应技术发挥了无法估量的作用。聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术， PCR技术不但能有效地检测基因的突变，而且能准确检测癌基因表达量。例如有研究报告CD44基因的异常拼接表达，几乎100%出现于某些泌尿系肿瘤，而对照组完全没有这种异常表达[2]。巢式聚合酶链反应（N?PCR）也称套式PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩散，所以称为巢式PCR。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，因此我们一般认为试验的敏感性增强。巢式PCR应用较广，比如在孕妇外周血中扩增男性胎儿单拷贝序列DNA,即DYS14基因，可以作为性相关基因疾病的产前诊断方法[3]；检测肉芽肿中副结核分支杆菌，用以探讨Crohn’s病的发病机制[4]；而且还能用于检测潜在的肿瘤标志物，Ioannidis 等[5]利用巢式PCR在58.5％的乳腺癌中检测到不稳定编码区结合蛋白（Coding Region instability Determinant?Binding Protein，CRD?BP）表达。但在一定情况下，N?PCR增加了每次试验的复杂性，因为它需要两次配制PCR体系，两轮PCR分开进行，而且，在N?PCR测定中，灵敏度过高可能会导致假阳性率增加。在导致PCR假阳性的因素中，产物污染是最严重、但又是可以避免的因素之一。通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性。   

　　表1  各组样本G?PCR和N?PCR的扩增成功率对比表（略）
   
　　结果显示经G?PCR和N?PCR后扩增成功例数略有不同，但其阳性率差异无显著性

　　将克隆性分析技术用于临床病例检测，需要省时、价低、易于操作，又要保证特异性和敏感性的方法，所以本实验将聚合酶链反应过程做一下改进，比较了正常组织、UDH和/ peri?PM、癌前病变即ADH和/peri?PM伴ADH、导管内癌不同病例组采用G?PCR和N?PCR的检测结果，其敏感性差异均无显著意义，而且两种方法扩增效果是一致的。
   
　　G?PCR不但简化操作步骤，节约试剂，检测过程仅需2天时间，而且极大地减少了交叉污染的可能性，如果能首先解决好处理标本过程中目的基因的得率问题，那么就可以取得事半功倍的效果，在一定范围内还可能提高扩增的特异性。因此，应用G?PCR检测常规石蜡包埋组织中乳腺肿瘤组织DNA特异性序列片段具有比N?PCR更大的临床实用价值。今后还将进一步探讨从新鲜组织标本所得DNA样本的克隆性分析，以更有利于临床诊断和鉴别诊断。

【】
  　　［1］ 朱少君，苏勤，王淑芳，等.女性外阴尖锐湿疣的克隆性[J].诊断病理学杂志，2003,10(2):81?84.

　　［2］ Raj Gv, Moreno JG, Gomella LG. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detetion of solid tumors[J]. Cancer, 1998, 82(8):1419?1441.

　　［3］ 迟洪滨,康志海,胡桂英，等.应用套式聚合酶链反应技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究[J].中华妇产科杂志,1999,34(1)：27?29.

　　［4］ Ryan P, Bennett M W, Aarons S, et al. PCR detection of Mycobacterium paratuberculosis in Crohn’s disease granulomas isolated by laser capture microdissection[J].Gut,2002, 51(5): 665?670.

　　［5］ Ioannidis P, Mahaira L, Papadopoulou A, et al. 8q24 Copy number gains and expression of the c?myc mRNA stabilizing protein CRD?BP in primary breast carcinomas[J]. Int J Cancer, 2003 ,104(1):54?59.