siRNA靶向Her?2逆转录病毒载体构建及其在SKOV3中的表达
作者：周颖，凌斌，高婷，陈敏，冯定庆，程志祥，朱园园，赵卫东，石永云，王梅梅，祝怀平
【摘要】 目的 构建并鉴定Her?2特异性siRNA逆转录病毒载体，将其导入SKOV3卵巢癌细胞中，并初步筛选有效抑制Her?2表达的细胞株。方法 体外合成含针对Her?2特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入逆转录病毒载体RNAi?Ready pSIREN?RetroQ，构建的载体通过测序、酶切鉴定后，脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中，嘌呤霉素筛选并挑选细胞克隆，收获病毒上清，将病毒上清转染SKOV3中，经过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her?2表达的SKOV3细胞株，并分别通过RT?PCR和免疫组化方法鉴定抑制Her?2表达的效果。结果 成功构建了重组逆转录病毒载体，转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了SKOV3， 并且抑制了Her?2的表达。结论 抑制Her?2表达的SKOV3细胞株的建立，为观察转染siRNA的逆转录病毒表达载体的肿瘤细胞恶性生物学行为变化奠定了实验基础。
【关键词】 Her?2；RNA干扰；逆转录病毒载体
Abstract：Objective To establish the stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her?2 by transfecting the recombinant retroviral vectors of siRNA specific for Her?2 into SKOV3 cell line. Methods We synthesized oligonucleotides for Her?2 in vitro, and cloned them into retroviral vector RNAi?Ready pSIREN?Retro?Q. Subsequently the plasmids were sequenced and digested to identify the successful construction of the recombinant retroviral vectors. The vectors?based RNAi were transfected into packing cell line PT67, which was selected by puromycin later. SKOV3 was infected by the virus supernatant of stable PT67 cell lines, and the stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her?2 were established by selecting with puromycin, many of which showed significantly reduced levels of Her?2 mRNA and p185 by RT?PCR and immumohistochemistry methods, compared to wild type SKOV3 cells. Results The recombinant retroviral vectors were constructed successfully, and the stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her?2 were established by the infection of virus supernatant secreted by the new stable PT67 cell lines. Conclusion The establishment of stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her?2 contributes to the study of the changes of malignant biological activity of tumor cell lines by transfection of siRNA retroviral vector specific for Her?2.
Key words：Her?2；RNA interference；Retroviral vector
0 引言
Her?2基因是人类肿瘤中常发生异常改变的基因之一，它定位于人类染色体17q21，由于其编码的蛋白产物分子量为185KD， 因此其蛋白命名为p185。 p185属于受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTK），过度表达可以赋予卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞更高的恶性生物学行为，且与肿瘤的化疗敏感性呈显著的负相关［1］，因此抑制p185的表达将有可能降低Her?2高表达的卵巢癌细胞的恶性生物学行为, 从而达到卵巢癌的目的，本研究利用RNAi技术的高效性和特异性，选择多种肿瘤中均高表达的癌基因Her?2为靶点，用逆转录病毒载体直接在肿瘤细胞内表达siRNA, 从而发挥高效、特异地抑制Her?2基因表达的作用，为逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为的研究提供了实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
逆转录病毒载体RNAi?Ready pSIREN?RetroQ购自BD公司，限制性内切酶MIu I、 BamH I、 EcoR I、 T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；大肠杆菌菌株E.coli DH5α购自上海生工生物工程有限公司；脂质体Lipofect2000、总RNA 提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；小剂量质粒提取试剂盒、逆转录试剂盒购自Promega公司；DEPC购自Sigma 公司； TaqDNA聚合酶购自华美生物工程有限公司；上、下游引物由上海生物工程有限公司合成。Her?2抗体(鼠抗人单抗)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SP9102 试剂盒为Zymed 公司产品。
1.1.2 细胞株
SKOV3细胞株购自上海细胞所；包装病毒细胞株PT67购自BD公司；细胞培养基DMEM、McCoy’s 5A Medium Modified、新生小牛血清、特级胎牛血清均购自GIBCOL公司。培养液均含有100mg/L的氨苄青霉素和链霉素，37℃、5%CO2饱和湿度下培养。嘌呤霉素购自Invitrogen公司，经生理盐水配成2.5mg/ml，－20℃保存备用。氯喹购自Sigma 公司，经生理盐水配成25mM， 4℃保存备用。聚凝胺(polybrene) 购自Sigma 公司，经生理盐水配成4mg/ml，4℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的设计及合成
根据GenBank提供的Her?2基因cDNA序列, 通过基因Blast, 挑选长为19bp与21bp的2段Her?2特异性寡核苷酸，其序列分别为5′?GGACATCTTCCACAAGAAC?3′，5′?GCTCTTTGAGGACAACTATGC?3′, 对照序列为5′?GTGCGTTGCTAGTACCAAC?3′。合成其发卡样两端配对寡核苷酸链, 用含9个碱基的圈连接起来，分别在5′和3′端引入BamHI与 EcoRI 酶切位点，并在转录终止信号后引入MIuI特殊酶切位点以检验所构建重组载体是否正确。
1.2.2 逆转录病毒载体的构建
将合成的上下链经过变性、复性后形成双链Her?2基因siRNA，采用双链定向亚克隆入逆转录病毒载体RNAi?Ready pSIREN?RetroQ，氯化钙转化方法 [2]转化大肠杆菌菌株E.coli DH5α, 氨苄青霉素（100mg/L）筛选出阳性克隆，提取质粒，见表1。表1 Her?2特异性发卡样寡核苷酸序列（略）
1.2.3 重组质粒Her?2/siRNA的鉴定
用MIu I将重组质粒进行限制性内切酶消化,酶切产物行0.5%琼脂糖凝胶电泳。阳性克隆分别命名为Her?2/siRNA?1、Her?2/siRNA?2、Her?2/siRNA? negtive control，纯化后送到上海生工生物工程有限公司测序鉴定。
1.2.4 重组质粒转染包装病毒细胞株
将包装病毒细胞PT67种到6孔板中，每孔1×105，完全培养基培养12h后用RPMI 1640洗涤2次，更换含25μM氯喹的DMEM培养1h，分别将Her?2/siRNA?1、Her?2/siRNA?2、Her?2/siRNA? negtive control各5μg转染PT67，脂质体Lipofect2000 5μl／孔。转染4h后，更换完全培养基，24h后加入1.875μg/ml嘌呤霉素筛选2～3周。
1.2.5 重组逆转录病毒感染SKOV3
产病毒细胞株PT67达90%汇合后换成无嘌呤霉素的完全培养基，24h后收集细胞上清，经0.45μm滤膜过滤，滤液-70℃保存或立即进行感染。SKOV3培养至对数生长期，弃去原液，加入1ml产病毒细胞株PT67的细胞上清滤液和1.33μg/ml的聚凝胺，37℃、5%CO2条件下培养1h, 重复感染1次, 继续培养24h，更换含1.875μg/ml嘌呤霉素的完全培养基筛选培养,每3～4d换液,约20d后筛选成活的细胞扩增至完全汇合, 以后改用含1.875μg/ml嘌呤霉素的完全培养基培养、传代，细胞株命名为SKOV3/siRNA?1、SKOV3/siRNA?2、SKOV3/siRNA? negtive control。
1.2.6 免疫组化
将SKOV3/siRNA?1、SKOV3/siRNA?2、SKOV3/siRNA? negtive control、SKOV3细胞分别接种在含有载玻片的6孔板中，24h后收获细胞爬片，经1×PBS洗涤2次，4％多聚甲醛固定10min，1×PBS洗涤1次，1∶100稀释浓缩原液，滴加在细胞爬片上，4℃过夜。通过北京中杉公司的SAP?9102检测试剂盒操作步骤检测一抗，滴加碱性磷酸酶显色剂显色。
1.2.7 RT?PCR
分别提取SKOV3/siRNA?1、SKOV3/siRNA?2、SKOV3/siRNA? negtive control、SKOV3细胞的总RNA，取定量好的RNA 1μg，根据Promega反转录试剂盒的步骤合成cDNA，将以cDNA产物稀释5倍。取5μl做模板，以编码区5′、3′端的引物（5′?TGCGGCTCGTACACAGGGACTT?3′、5′?TGCG GGAGAATTCAGACACCAACT?3′）扩编码区420 bp ( PCR反应参数：94℃ 变性3min， 94℃ 1min， 56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 7min延伸，1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测)。同时以引物（5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA?3′、5′?CTCCTTA ATGTCACGCACGATTT?3）扩增管家基因actin作内对照，产物大小约500bp。（PCR反应参数：94℃变性3min， 94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 7min延伸，1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测）。
2 结果
2.1 酶切鉴定重组质粒
由于插入片断中含有MIu I特殊酶切位点,故只需用单一酶MIu I消化后与未酶切的重组质粒进行对比即可。重组质粒经MIu I酶切后显示出一条6.5kb左右的条带，插入片段由于太小（69bp或73bp）电泳难以显示，见图1。将重组质粒Her?2/siRNA?1、Her?2/siRNA?2、Her?2/siRNA? negtive control送到上海生工生物有限公司测序，测序结果均与目的序列完全相同。表明构建载体成功。
2.2 免疫组化检测p185蛋白的沉默
经免疫组化检测p185蛋白，见图2。载体Her?2/siRNA?1、Her?2/siRNA?2均可以有效沉默p185蛋白的表达，以Her?2/siRNA?2更为明显。
2.3 RT?PCR检测Her?2基因的沉默
经RT?PCR检测Her?2 mRNA的表达，载体Her?2/siRNA?1、Her?2/siRNA?2均可以有效沉默Her?2 mRNA的表达，以Her?2/siRNA?2更为明显，结论与免疫组化的结果相同，见图3。
3 讨论
癌基因Her?2的扩增及其产物p185的过度表达可以赋予肿瘤细胞更高的恶性生物学行为，与多种上皮细胞起源的肿瘤发生关系密切。p185表达与否尚与乳腺癌、卵巢癌、胃癌以及非小细胞肺癌的不良预后有关，也与肿瘤对化疗、生物的敏感性呈明显的负相关，Her?2被认为是上皮细胞起源的肿瘤治疗的最有效靶点之一［3，4］。不难理解，探索针对Her?2基因或p185蛋白为靶点的有效治疗方法，势必为众多种类恶性肿瘤的治疗寻求一种新的策略。近年来人源化抗p185单抗（Hereceptin）在临床上已经应用于治疗高表达p185的肿瘤患者，显示出较好的疗效 [5]。但是其确切的临床效果尚待进一步的验证，目前对应用Hereceptin争议的焦点在于：①循环血液中可溶性的p185蛋白可影响单抗的疗效；②单抗可能增强肿瘤细胞的侵袭能力［6，7］。为了避免上述治疗过程中的不足，探索更好的肿瘤治疗方法，综合分析国内外有关对Her?2基因／p185蛋白，本课题选择Her?2基因的转录环节—mRNA作为靶点进行干预研究，而非p185蛋白作为靶点，从而在癌基因表达的上游进行干预，以期从源头上抑制了p185蛋白的表达，其效果可能更佳，而且可以避免直接利用抗p185单抗所引起的免疫反应和其他副作用。
RNAi是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA引起与其同源mRNA的特异性降解，抑制其相应基因的表达具有高特异性、高效性、高稳定性等重要的分子生物学特性［8，9］。实验选用的逆转录病毒载体为RNAi?Ready pSIREN?RetroQ，特点是抗嘌呤霉素，质粒产量低，但是转染效率高 [10]。本课题成功建立了沉默Her?2基因表达的SKOV3细胞株，RT?PCR和免疫组化方法均证明针对Her?2基因设计的靶序列构建的载体Her?2/siRNA?1、Her?2/siRNA?2能够有效抑制Her?2基因的表达，为观察转染siRNA的逆转录病毒表达载体的肿瘤细胞恶性生物学行为变化，并与亲本细胞的生物学行为之间进行比较奠定了实验基础。（本文图2见第318页）
【文献】
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