狭霉素及其应用研究的新进展

【摘要】  狭霉素(angustmycin)有A、B和C三个组分，其中A和C为核苷类化合物，B组分为腺嘌呤。狭霉素A是一种特异的鸟嘌呤核苷酸(GMP)合成酶抑制剂，在实验室中广泛应用。近十年来，我国工作者发现它具有植物细胞分裂素的生物活性，在植物学研究及农业生产上也有良好的应用前景。

【关键词】  狭霉素A 作用机制 应用研究

    Advances in angustmycins and their applications

     ABSTRACT  Angustmycins have three constituents: angustmycin A, B and C. Angustmycin A and C are nucleoside antibiotics, and angustmycin B is identical with adenine. Angustmycin A (also called lingfasu) has been applied in the laboratory as a specific inhibitor of GMP synthase. In the last ten years, Chinese scientists have found that angustmycin A had biological activities of cytokinin. It has a promising applications in the botanical research and the agricultural production.

    KEY WORDS  Angustmycin A;  Mechanism of action;  Application research

    狭霉素(angustmycins)是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopics var. angustmyceticus)产生的抗生素。已知它包括狭霉素A(angustmycin A)、狭霉素B(angustmycin B)和狭霉素C(angustmycin C)三种组分，其中组分B是腺嘌呤(adenine)，A和C是腺嘌呤的核苷类衍生物(Fig.1)。自20世纪50年代狭霉素被发现以来，由于其抗菌谱极窄且抗菌活性较弱，并不为人们所瞩目。然而近十多年来的研究进展重新唤起了

    Fig.1    The structures of angustmycin A and C人们对狭霉素的兴趣，特别是我国农业科学工作者发现狭霉素A对植物有明显的生物活性，被视为一种新的植物生长调节剂。研究者将其重新命名为“PGR?08”(plant growth regulator?08，植物生长调节剂?08)和“灵发素”(lingfasu，LFS)，为狭霉素A的深入研究与应用开辟了新的领域。下面就狭霉素的发现、研究进展及其新用途作一概述。

    1  狭霉素的发现

    1954年东京大学农业化学系Yuntsen等在寻找抗结核菌株的过程中从东京附近的土壤中分离到一个新菌株6A?704［1］。该菌株能产生一种特异性抑制分枝杆菌的物质，对其它的革兰阴性、阳性细菌、真菌和酵母无效。通过分离纯化，得到了粗结晶，并且初步对其理化性质、生物活性和稳定性进行了测定。

    1956年Yuntsen等又发现他们以前获得的狭霉素是由三个组分组成， 即狭霉素A、 B和C， 并对它们的分离技术、理化性质等方面做了进一步研究［2］。

    狭霉素A  含水结晶的熔点128～130℃，163～164.5℃降解；甲醇中的结晶不含水，172～174℃降解。在260nm处有最大紫外吸收峰(甲醇溶液中)。狭霉素A溶于水、甲醇、乙醇、吡啶、乙酸、二甲基甲酰胺、苯酚，难溶于丁醇、二氧六环，不溶于乙醚、丙酮、氯仿、二硫化碳、乙酸乙酯和其它有机化合物。对Schiff、ninhydrin、FeCl3、Sakaguchi、Molisch、Indole、ammoniacal?AgNO3、Kossel和Fearon?mitchel试剂呈阳性反应，对Fehling试剂呈阴性反应。

    狭霉素B  在350～355℃降解，220℃左右升华，分子式C5H5N5，260nm的紫外最大吸收、红外光谱均与腺嘌呤相同。因此，狭霉素B即为腺嘌呤。

    狭霉素热稳定性较好，在pH5～9的条件下能保持稳定。但在100℃，pH2的条件下，5min失活。

    通过连续稀释实验，确定狭霉素抑制Mycobac?terium 607和Mycobacterium phlei生长的最低抑菌浓度为25μg/ml。对于恶性Mycobacteria H37Rv在浓度100μg/ml时也没有活性。狭霉素是几乎没有毒性的物质。小鼠腹腔内注射2.5g/kg，没有任何毒副反应。

    2  研究进展

    1959年Eble等［3～6］对狭霉素C的研究结果显示，狭霉素C极易溶于二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和热水中，室温下的溶解度为：水8mg/ml，甲醇8mg/ml，乙醇6mg/ml，1?丁醇2mg/ml，乙酸乙酯0.23mg/ml。25℃的比旋度为-53.7°(c，1%的二甲基亚砜溶液)、-68°(c，1%的二甲基甲酰胺溶液)。在酸性条件下不是很稳定，pH2.0，30℃的半衰期是18h；中性条件下0到25℃很稳定。在0.01mol/L酸溶液中259nm时紫外光谱的吸收系数是508；同时证实了狭霉素C就是阿洛酮糖腺苷(psicofuranine)，结构为6?amino?9?(β?D?psicofuranosyl)?purine。狭霉素C在体内有抗微生物和抗肿瘤活性，小鼠防护实验中无论口服还是皮下给药都能有效的抑制Streptococcus hemolyticus和Escherichia coli。对Diplococcus pneumoniae、Proteus vulgaris、Pseudomonas aeruginosa和Salmonella的感染没有活性，对病毒和线虫感染也不起作用。该抗生素还能降低小鼠肾细胞Micrococcus aureus慢性感染的数目。在普通的肉汤和琼脂培养基中，狭霉素C在体外没有活性，但在含有肝脏提取液的半合成培养基中，检定板在检测前冷藏4h的情况下，狭霉素C在体外对Salmonella pullorum、Staphylococcus aureus、Sta?phylococcus albus、Streptococcus hemolyticus和Esche?richia coli有活性。狭霉素C在体外用平板扩散法检测的限度：水中10mg/ml，血液中3mg/ml；浊度评价的检测限度0.5mg/ml。检定菌均为Staphylococcus aureus FDA?209P。

    Yuntsen等在1958年报道了狭霉素A的结构［7］。随着研究的深入，1964年Hocksema通过核磁共振光谱认为以前提出的结构有误，指出在糖基中不存在C?甲基基团［8］，对1958年报道的结构进行了修正，同时证明了狭霉素A就是德夸霉素(decoyinine)［8］。德夸霉素原为阿洛酮糖腺苷发酵过程的副产物，与狭霉素A具有相同的分子式，水合产物、甲醇和乙醇的溶剂化物有相同的熔点，相同的红外光谱。通过两者的核磁共振光谱及其相关降解产物的比较，显示两者同质。

    1966年Chassy等推断出德夸霉素中糖的结构为6?Deoxy?D?erythro?2，5?hexodiulose，完成了糖的生物合成过程的研究，指出糖的合成直接来源于D?［1?14C］葡萄糖或14C标记的D?果糖。同时通过14C标记狭霉素C中的腺嘌呤，证实了在Streptomyces hygroscopicus发酵过程中狭霉素A、C可以相互转化［9］。

    1968年McCarthy等完成了狭霉素C到狭霉素A的化学转化过程［10］。狭霉素C经过下面5个步骤，转换为狭霉素A。

    * 与原甲酸乙酯(三乙氧基甲烷)在15℃反应48～96h；

    * 在纯二氧杂环乙烷中与三氟化硼乙醚反应；

    * 在吡啶中与对甲苯磺酰氯反应；

    * 在叔丁醇?吡啶溶液中与叔丁醇钾反应；

    * 在冰乙酸中与二氧杂环乙烷在50℃反应30h

    20世纪60年代末，我国抗生素工作者从我国的土壤中也筛选到了狭霉素的产生菌，获得了狭霉素的A、B和C结晶。A组分命名为“Antibiotic 8”(抗菌素8号)，被证实对黏膜炎布拉汉菌(Branhamella catarrhalis)有很强的活性。该结果被收录于1977年版的《抗菌素生物理化特性?第1分册》［11］。

    近年来我国抗生素工作者又对狭霉素进行了光谱学研究，特别是通过X射线单晶衍射的测定，进一步明确了狭霉素A晶体的立体结构［12］(Fig.2)。狭霉素A晶体结构属三方晶系，空间群为P3或P3z；晶胞参数：a=b=10.736(1)?，c=10.030(1)?，γ=120.000，V=1001.19(1)?3，Z=3；分子式为C11H13O4N5·H2O，含一分子结晶水，不含结晶水的相对分子质量为279.26。分子的骨架有三个环，A环和B环共平面，C环呈信封式构象，A、B环与C环的二面角值为72.9(4)0。

    3  狭霉素的抗菌活性与作用机制Fig.2    The spatial structure of angustmycin A

    1961年Miyairi等［13］报道，狭霉素A、C在合成培养基中均有抗微生物的活性，在天然培养基中无活性，其活性能被鸟嘌呤、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷及相关物质抑制。狭霉素A能抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)核酸片段合成过程中32P的进入，通过紫外吸收法可以看到核酸数量的减少；在狭霉素A作用于枯草芽孢杆菌PCI219 1h后再加入14C标记的氨基酸，可以看到狭霉素A能减弱14C标记的氨基酸进入枯草芽孢杆菌PCI219机体的蛋白质片段。根据这些生化现象与专性抑制剂化合物的结构推断，狭霉素A在微生物的核酸及蛋白质的生物合成代谢中具有抑制剂作用，所以表现出抗微生物的活性。狭霉素C抗肿瘤转移的作用机制也是类似情况。

    1964年Bloch［14］进一步明确了狭霉素A的作用机制，指出它对磷酸核糖焦磷酸化激酶有抑制作用，从而抑制XMP(黄嘌呤核苷酸)转化为GMP(鸟嘌呤核苷酸)。

    4  狭霉素A的应用

    4.1  在实验室研究工作中的应用

    狭霉素A在国外目前最主要的是把它作为一种特异性的GMP合成酶抑制剂，比较广泛地用于实验室研究工作。

    (1)加入狭霉素A，枯草芽孢杆菌在营养丰富的条件下孢子的形成为指数性增长［15］。

    (2)狭霉素A可以影响枯草芽孢杆菌细胞壁的必要组成成分肽聚糖(peptidoglycan)的合成和翻转。加入狭霉素A 5min后，细胞壁合成速率下降了50%。它除了可以抑制细胞壁生物合成途径的最后一部分，还可以防止细胞的自溶和细胞壁翻转。在氨基酸和葡萄糖存在的条件下，加入狭霉素A可以除去细胞中的鸟嘌呤核苷，从而诱导枯草芽孢杆菌孢子的形成［16］。

    (3)在特定的培养基中，狭霉素A可以引起枯草芽孢杆菌中顺乌头酸激酶活性和citB基因复制的同步增长［17］。

    (4)狭霉素A可以使细胞在限制性培养基中生成气生菌丝；它还能有效地抑制液体培养基中水生孢子的形成［18］。

    (5)狭霉素在其它新陈代谢副产物反馈抑制的条件下，控制枯草芽孢杆菌孢子形成的开始和进展。它不能逆转枯草芽孢杆菌野生菌株中代谢副产物对α?淀粉合成酶的抑制作用，但是可以促进突变株中合成的能力。它不影响α?淀粉合成酶的活性［19］。

    (6)狭霉素A诱导松弛型枯草芽孢杆菌菌株中基因comG的表达能力，同时使细胞内GTP(鸟苷三磷酸)水平的急剧降低。在指数期到稳定期之间加入狭霉素A，松弛型菌株中的转换数提高了100倍［20］。

    4.2  在植物和农业上的应用

    植物细胞分裂素(cytokinin，CTK)是一类普遍存在于植物界且非常重要的植物激素，直接影响植物的细胞分裂、器官建成、叶片衰老和其它一些重要的生理过程。我国科技工作者在20世纪80年代末首先证明了狭霉素A具有植物细胞分裂素的生物活性，并用研究代号PGR?08发表了最初的部分研究结果［21，22］。用高压液相层析(HPLC)技术证明，PGR?08在植物组织培养基灭菌时所需要的pH及高温高压条件下不被破坏分解，这种稳定性为其在植物组织培养中的推广应用提供了基本保证。为便于在农业领域推广应用，随后又以“08”的谐音取名为“灵发素”(lingfasu，LFS)，并在促进种子萌发、植物组织培养和蔬菜保鲜等方面成功地加以应用，取得了良好的效果。将狭霉素A的研究从医药学引入植物学和农学，开创了新的研究领域，并在国内获得了发明专利［23］(专利号：ZL 02 154161.2)。

    (1)“灵发素”对小麦种子萌发与幼苗生长的影响［24］  通过PGR?08浸种处理，在(25±1)℃条件下，小麦种子发芽率48h内比对照增加9.3%～19.3%，同时种子中淀粉酶的活性比对照增加106.3%～162.5%。育苗6d后，苗高与根长都相当于对照的2～4倍。25d后，麦苗的一级分蘖相当于对照的1.6～2.3倍，并有1/4～1/2的植株出现二级分蘖。同样条件下，对照组却无二级分蘖。上述结果证明PGR?08有促进植物生长的生物活性。

    (2)PGR?08对小麦幼苗抗旱性的影响［25］  PGR?08浸种，可使4叶期的小麦幼苗在干旱胁迫下，叶片气孔阻力增大，蒸腾强度下降，保水力提高，束缚水/自由水比值上升，而总含水量无明显变化。同时，叶片中叶绿素、可溶性蛋白质的含量亦维持在较高水平，萎蔫系数略有下降。从而证明PGR?08对植物有一定的抗逆和抗衰老作用。

    (3)“灵发素”直接诱导马铃薯愈伤组织分化试管薯［26］  目前国内、外都是通过诱导马铃薯试管苗匍匐茎或者茎段腋芽的膨大来生产试管薯。用LFS直接诱导马铃薯愈伤组织分化试管薯，不仅直接证明LFS具有促进植物细胞分裂和诱导植物器官分化的生物活性，而且可能为马铃薯试管薯的获得提供一条更简便的途径。

    (4)“灵发素”对三七愈伤组织发生和增殖的影响［27］  以三七茎段为外植体，用以下5组MS改良培养基进行对比研究：①MS(Murashige?Skoog)+2，4?D 2.0(mg/L，下同)(CK)；②MS+2，4?D 2.0+N6?BA(N6?苄基腺嘌呤)2.0；③MS+2，4?D 2.0+KT(激动素)2.0；④MS+2，4?D 2.0+ZT(玉米素)2.0；⑤MS+2，4?D 2.0+LFS 2.0。结果表明，在CK的基础上添加LFS可以促进茎段愈伤组织早发生1～2周，诱导率达81%，比CK高出30%以上。LFS能使愈伤组织的鲜重在40d内增加360.2%，而KT、ZT和N6?BA仅增加13.4%～21.8%。以平均接种1g愈伤组织计，40d内含LFS的第⑤组收获干物质81.5mg，另外4组只能收21.6～25.9mg。特别是LFS可以使愈伤组织继代保存3年以上未表现老化迹象，一直保持增殖能力，提示LFS有显著促进植物细胞分裂的能力，这正是一般植物细胞分裂素典型的生物活性。

    (5)“灵发素”对三七胚状体发生及其成苗的影响［28］  以MS为基本培养基，加入适量的2，4?D和LFS，暗处培养，三七茎段愈伤组织可被诱导出胚状体，2～3个月内发生机率可达90%左右。MS+2，4?D 1.5+LFS 2.0于光下培养，约有30%以上的胚状体能发育成健壮的全苗，说明LFS有促进植物分生组织进行器官分化的活性。

    (6)在罗汉果组织培养中的生物效应［29］  在罗汉果组织培养中，LFS可诱导外植体腋芽优先萌发，并迅速生长。由于营养分配利用的原因，同时抑制了愈伤组织的发生和生长，在继代苗的增殖中也有同样表现。愈伤组织的显著减少对保持组织培养苗的遗传稳定性，减少不良变异，具有积极意义。以MS为基本培养基，添加LFS 0.2mg/L，可使罗汉果单节茎段外植体成苗率达90%以上；添加等量的N6?BA或KT时，成苗率不足30%，且生成大量愈伤组织。

    LFS还可以显著促进不定根的发生与生长，无须添加任何生长素，即可使罗汉果组织培养继代苗发育成根苗齐全的再生植株。这有利缩短生产周期，提高罗汉果组织培养苗的质量。目前学术界普遍认为N6?BA和KT都是抑制植物不定根的发生。LFS与N6?BA及KT同属腺嘌呤类细胞分裂素，但对植物不定根的发生，却有截然相反的作用。对此许鸿源认为，如能深究这一现象的内在原因，将有利于揭示植物不定根发生的生理机制。

    (7)对蔬菜菊花脑的保鲜作用［30］  菊花脑具有清热解毒、平肝明目的功效，是一种保健型蔬菜。LFS能显著抑制其呼吸强度，减缓叶绿素和维生素C的降解速度。在(8±2)℃时，10mg/L的LFS比同浓度的N6?BA、KT和3mg/L的CPPU(N?2?氯?4?吡啶基，N?苯基脲)有更好的保鲜效果，储存10d外观仍青绿鲜活，无任何异味。

    5  结束语

    狭霉素A作为一种原来不太被人们重视的抗生素品种，随着应用研究的不断深入，逐渐扩大了它的使用范围，特别是我国学者在农业方面的研究，使这个在医药界尚无大作为的抗生素摇身变成了一种新的植物生长调节剂，在植物学和农学方面展现了良好的应用前景和社会价值。但是，在国内狭霉素A(灵发素，PGR?08)至今没有化生产，国外的价格又十分昂贵(Alexis生产，280元/mg)。所以笔者认为，若能够对狭霉素A进行深入的研究开发，并实现其产业化批量生产，满足研究和农业上生产的需要，将会有光明前景。

【】
  ［1］ Yuntsen H, Yonehara H, Ui H. Studies on a new antibiotic angustmycin I ［J］. J Antibiot,1954,7(4):113

［2］ Yuntsen H, Ohkuma K, Ishii Y, et al. Studies on angustmycin Ⅲ ［J］. J Antibiot,1956,9(6):195

［3］ Eble T E, Hoeksema H, Boyack G A. Psicofuranine Ⅰ. Discpvery, isolation, and properties ［J］. Antibiot Chemo?ther,1959,Ⅸ(7):419

［4］ Lewis C, Reames H R, Rhuland L E. Psicofuranine Ⅱ. Studies in experimental animal infections ［J］. Antibiot Chemother,1959,Ⅸ(7):421

［5］ Vavra J J, Dietz A, Churchill B W, et al. Psicofuranine Ⅲ. Production and biological studies ［J］. Antibiot Chemother,1959,Ⅸ(7):427

［6］ Hanka L J, Burch M R, Sokolski W T. Psicofuranine Ⅳ. Microbiological assay ［J］. Antibiot Chemother,1959,Ⅸ(7):432

［7］ Yuntsen H. On the studies of angustmycins VI. Chemical structure of angustmycin A ［J］. J Antibiot,1958,11(2):79

［8］ Hoeksema H, Slomp G. Angustmycin A and decoyinine ［J］. Tetrahedron Lett,1964,5(27):1787

［9］ Chassy B M, Sugimori T, Suhadolnik R J. The biosynthesis of the 6?deoxy?D?erythro?2,5?hexodiulose sugar of decoyinine ［J］. Biochim Biophys Acta,1966,130:12

［10］ McCarthy J R, Robins R K, Robins M J. Purine nucleosides XXII. The synthesis of angustmycin A (decoyinine) and related unsaturated nucleosides ［J］. J Am Chem Soc,1968,28(8):4993

［11］ 抗菌素生物理化特性?第1分册［M］. 北京：人民卫生出版社，1977：102

［12］ 解云英，姜蓉，许鸿章. 两株吸水链霉菌所产Angustmycins的光谱学研究［J］. 抗生素杂志，2004，29(11)：11

［13］ Miyairi N, Tanaka N, Umezawa H. Effect of angustmycin A on incorporation of 32P and 14C?amino acids ［J］. J Antibiot,1961,XIV(3):119

［14］ Bloch A, Nichol C A. Inhibition of ribosephosphate pyrophosphokinase activity by decoyinine, an adenine nucleoside ［J］. Biochem Biophys Res Communications,1964,16(5):400

［15］ Ikehara K, Okamoto M, Sugae K. Induction of Bacillus subtilis sporulation by decoyinine and the concomitant disappearance of ppGpp in vegetative cells ［J］. J Biochem,1982,91(3):1089

［16］ Uratani B, Lopez J M, Freese E. Effect of decoyinine on peptidoglycan synthesis and turnover in Bacillus subtilis ［J］. J Bacteriol,1983,154(1):261

［17］ Dingman D W, Rosenkrantz M S, Sonenshein A L. Relationship between aconitase gene expression and sporulation in Bacillus subtilis ［J］. J Bacteriol,1987,169(1):3068

［18］ Ochi K. Metabolic initiation of differentiation and secondary metabolism by Streptomyces griseus: significance of the stringent response (ppGpp) and GTP content in relation to a factor ［J］. J Bacteriol,1987,169(8):3608

［19］ Nicholson W L, Chambliss G H. Effect of decoyinine on the regulation of α?amylase synthesis in Bacillus subtilis ［J］. J Bacteriol,1987,169(12):5867

［20］ Inaoka T, Ochi K. RelA protein is involved in induction of genetic competence in certain Bacillus subtilis strains by moderating the level of intracellular GTP ［J］. J Bacteriol,2002,184(14):3923

［21］ 许鸿源. PGR?08生物活性及其应用研究(简报) ［J］. 广西农学院学报，1989，8(1)：4

［22］ 许鸿源，许鸿章，杨美纯，等. PGR?08理化性质及生物活性的研究［J］. 广西植物，2003，23(4)：461

［23］ 许鸿源. 狭霉素在植物学和农学上的应用［J］. 发明专利公报，2003，19(34)：6

［24］ 许鸿源，许鸿章. PGR?08对小麦种子萌发与幼苗生长的影响［J］. 广西农业大学学报，1995，14(3)：213

［25］ 周岐伟，许鸿源，杨美纯. PGR?08对小麦幼苗抗旱性的影响［J］. 广西农业大学学报，1996，15(4)：1005

［26］ 许鸿源，吴丹红，许鸿章，等. “灵发素”直接诱导马铃薯愈伤组织分化试管薯［J］. 植物生通讯，2003，39(5)：465

［27］ 许鸿源，蒙爱东，李春霞，等. 灵发素对三七愈伤组织发生和增殖的影响［J］. 中药材，2004，27(1)：711

［28］ 许鸿源，蒙爱东，李春霞，等. 灵发素对三七胚状体发生及其成苗的影响［J］. 中药材，2004，27(10)：1001

［29］ 邓惠文，许鸿源，江文，等. 药品与食品兼用蔬菜菊花脑的保鲜试验［J］. 蔬菜产业，2005，1：13

［30］ 许鸿源，周凤钰，何冰，等. LFS、N6?BA和KT在罗汉果组织培养中不同的生物效应［J］. 种子，2006，25(8)：4