花边莲提取液对人肺癌SPC
作者：韦星，万福生，涂硕，余乐涵，杨香生
【关键词】 花边莲；,,SPC
摘要：目的探讨花边莲提取液对人肺癌SPCA1细胞凋亡相关基因survivin和caspase3表达的影响。方法采用体外培养人肺癌SPCA1细胞，实验随机分为正常对照组、花边莲处理组（浓度分别为12.5，25和50 ml/L）和顺铂（DDp25 mg/L）组，半定量RTPCR检测survivin和caspase3 mRNA表达水平，二步法免疫组化检测Survivin和Caspase3蛋白表达变化。结果与正常对照组相比，花边莲各浓度组caspase3 mRNA和蛋白表达显著上升（P＜0.01），survivin mRNA和蛋白表达明显下降（P＜0.01）。结论 花边莲提取液诱导SPCA1细胞凋亡的分子机理可能与上调caspase3基因表达和下调survivin基因表达有关。
关键词：花边莲； SPCA1细胞； 细胞凋亡； survivin; caspase3
Influence of HuaBianLian Extract on Expression of Apoptosis Associated Genes Survivin and Caspase3 in Human Lung Cancer SPCA1 Cells
Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of HuaBianLian(HBL) extract on expression of apoptosis associated genes survivin and caspase3 in human lung cancer SPCA1 cells.MethodsCultured human lung cancer SPCA1 cells were randomly divided into the control group (the negative control group),HBL-treated groups(12.5,2.5,50 ml/L) and DDP(25 mg/L) group (the positive control group).The expression of survivin and caspase3 mRNA was detected by semiquantitive RTPCR .The expression of survivin and caspase-3 proteins were detected by twostep immunhistochemical staining.ResultsCompared with control group ,the expression of caspase 3 mRNA and protein increased significanty (P＜0.01),while survivin mRNA and protein decreased markedly in HBL groups (P＜0.01).ConclusionThe molecular mechanism of HBL apoptosis inducing of SPCA1 cells may be associated with the upregulating expression of caspase-3 gene and downregulating expression of survivin gene.
Key words：HuaBianLian; SPCA1 cells; Apoptosis; Survivin gene; Caspase3 gene
前期研究表明，中药复方花边莲HuaBianLian, HBL提取液对人肺癌SPCA1细胞具有较强的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用［1］，但其作用机理尚不明确。大量研究证据表明，细胞凋亡调节机理是多种基因互相作用、综合调节的结果。生存素（Survivin）是最近发现的凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein,IAP），它通过直接作用于细胞凋亡途径中的终末效应酶半胱氨酸蛋白酶Caspase3和Caspase7阻断细胞凋亡途径［2］。Caspase3与凋亡关系最为密切，参与多种因素诱导的细胞凋亡。本实验观察HBL提取液对人肺癌SPCA1细胞凋亡相关基因survivin和caspase3表达变化的影响，探讨该药方抗肿瘤作用的可能分子机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞人肺癌SPCA1细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。
1.1.2 试剂与仪器胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，顺铂（DDP）为锦州九泰药业有限责任公司产品，RNA提取试剂盒为BIODEVTECH公司产品，Access RTPCR system为Promega公司产品，PCR引物为上海生工生物工程公司合成，鼠抗survivin(D8)：sc 17779和caspase3(E8)：sc7272单克隆抗体为Santa cruz公司产品，PowerVisionTM免疫组化检测试剂（PV6001/6002）为北京中杉金桥生物技术公司产品。倒置显微镜（Cioc），BX51型显微镜（OLYMPUS），PCR仪（杭州郎基）。
1.2 方法
1.2.1 HBL提取液的制备取白花蛇舌草、半枝莲、半边莲和白英等（购买于江西南华医药有限公司中药材分公司，产地江西）干品100 g，用1 000 ml水浸泡1 h，加热煮沸后小火煎熬60 min，室温冷却，120目网筛过滤，弃药渣，滤液离心（3 000 r/min，20 min），2次。取上清液，浓缩至50 ml，调pH值为7.0～7.2，0.22 μm过滤除菌，获生药含量为2.0 g/ml白英水提液，5 ml小瓶分装，-20℃保存备用，实验时将含10%胎牛血清RPMI 1640培养液稀释至所需的药物浓度。
1.2.2 细胞培养和药物处理SPCA1细胞，以含100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10%FBS的RPMI 1640培养液，在37℃，5%CO2的培养箱中培养，细胞生长至对数增殖期，更换含0，12.5，25，50 ml/L HBL新鲜培养液，用DDP（25 mg/L）为阳性对照组，药物作用时间为48 h。
1.2.3 半定量RTPCR检测survivin和casapse-3 mRNA表达药物处理细胞48 h后，收集各组细胞，PBS冲洗两次，按总RNA提取试剂盒的说明书提取RNA。引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证。survivin引物：Sense：5’TCTCAAGGA CCA CCG CAT CT3’，Anti-sese：5’GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA3’，扩增产物长度289 bp；caspase-3引物：Sense:5’-GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA-3’，Anti-sese:5’ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG3’,扩增产物长度270 bp;β-actub引物：Sense：5’-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3’，Antisense：5'AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT -3'，扩增产物长度621bp。按试剂盒说明采用一步法进行RTPCR。反应体系总体积50 μl，逆转录45℃×45 min，AMV RT灭活和预变性94℃×2 min，然后进行PCR 35个循环（94℃×30 s，55℃×1 min，72℃×2 min），最后延伸72℃×7 min，终止于4℃。各取PCR产物10 μl,加溴酚蓝指示剂2 μl，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1 h（电压90 V），然后用紫外透射分析仪观察结果并拍照，并通过凝胶图像密度扫描仪扫描分析各条带的光密度，以 βactin 的表达量为对照并比较各组survivin 和caspase3的相对表达量。
1.2.4 免疫组化法检测Survivin和Caspase3蛋白表达按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作：药物处理细胞48 h后，收集各组细胞，PBS冲洗两次，制成细胞悬液涂片，风干后丙酮固定15 min；3%过氧化氢孵育5 min，以阻断内源性过氧化物酶；滴加一抗（稀释1∶100），室温90 min，PBS冲洗，2 min×3次；滴比IgG抗体HRP多聚体20～30 min。以PBS冲洗，2 min×3次；以PBS代替一抗作为阴性对照。结果分析：Survivin和Caspase3蛋白定位于胞浆，细胞浆染为棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。利用CMLAS彩色病理图像分析系统（北京航空大学空军总研制）进行分析。随机计数低倍镜下10个视野中的阳性细胞占该视野细胞总数的比率，得出每组细胞的阳性率。
1.2.5 统计学方法实验数据采用±s表示，用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，参数统计采用t检验。
2 结果
表1 Survivin和Caspase3蛋白表达变化（略）
与对照组相较★P＜0.01；n=10
2.1 HBL提取液对SPA1细胞survivin mRNA和caspase-3 mRNA表达的影响药物处理SPCA1细胞48 h后，随着HBL提取液浓度的升高，RTPCR产物琼脂糖凝胶电脉显示survivin基因条带逐渐变细变暗，见图1，caspase3基因条带逐渐变粗变亮，见图2；3次结果经光密度扫描分析可见：survivin/βactin光密度积分值之比随HBL提取液浓度增加而呈逐渐降低的趋势（P＜0.01），caspase3/βactin光密度积分值之比随HBL提取液浓度增加而逐渐增高的趋势（P＜0.01），见图3~4。
M.DNA marker A.Control B.12.5 ml/L HBL C.25ml/L HBL D.50 ml/L HBL E.25 mg/L DDP
图1 RTPCR检测survivin基因mRNA表达（略）
M.DNA marker A.Control B.12.5 ml/L HBL C.25 ml/L HBL D.50 ml/L HBL E.25 mg/L DDP
图2 RTPCR检测caspase3基因mRNA表达（略）
与对照组比较，P＜0.01；n=3
图3 survivin mRNA表达结果（survivin/β-actin）（略）
与对照组比较，P＜；n=3
图4 caspase3 mRNA表达结果（caspase3 actin）（略）
2.2 HBL提取液对SPCA1细胞Survivin和Caspase3蛋白表达的影响HBL提取液和DDP处理SPCA1细胞48 h后，免疫组化检测结果显示，与正常对照组相比，HBL各浓度组Caspase3蛋白表达显著增高（P＜0.01），Survivin蛋白表达显著下降（P＜0.01）。见表1。
3 讨论
中药成分复杂，特别是中药复方成分更为复杂，其作用多环节，多靶点且量-效关系难以控制，绝大多数中药的作用机理不清成为制约中药化的关键问题，也是限制中药走向世界的一个重要因素。本实验利用分子生物学技术对中药复方HBL的分子机理进行探讨。免疫组化检测结果显示，HBL各浓度组Caspase3蛋白表达显著增高，Survivin蛋白表达显著下降，且呈一定的剂量依赖性；RT-PCR检测结果显示，随着HBL浓度的增加，caspase3 mRNA表达上调，而survivin mRNA表达下调。提示中药复方HBL对人肺癌SPCA1细胞凋亡相关基因caspase-3和survivin表达具有明显调控作用。Caspase家族是Fas/Apo1介导的凋亡信号转导途径的关键效应分子，通过靠近天冬氨酸残基的切割效应，使得Caspase家族成员以类似于酶原激活的方式相互激活，并形成级联放大效应，而Caspase3是位于级联下游操纵底物酶切的重要效应因子，它是目前已知与凋亡关系最密切的Caspase家族成员之一。Caspase3通过激活DNase、酶切多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADPribose polymerase,PARP）片段化、降解细胞骨架蛋白及一些癌蛋白等机制，使细胞赖以生存的关键物质不可逆性地破坏，最终导致细胞凋亡［3］。此外，由于Caspase3是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度。Tormanen等［4］研究了非小细胞肺癌Caspase3、Caspase6和Caspase8的表达和凋亡，发现Caspase高表达和肿瘤密切相关，并反映肿瘤细胞正向凋亡。本实验结果提示，HBL高表达和肿瘤密切相关，并反映肿瘤细胞正凋亡发展。本实验结果提示，HBL提取液能显著提高人肺癌SPCA1细胞capase3 mRNA和蛋白的表达，参与HBL提取液诱导SPCA1细胞凋亡。Survivin蛋白在肿瘤凋亡调控过程中的作用越来越引起人们的重视，并被认为是肿瘤的一个新靶点。IAP是抑制细胞凋亡的重要成分，这一蛋白家族抑制细胞凋亡的作用远远大于Bclz家族的作用，Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子［5］。许多研究表明Survivin不同于Bcl2家族和其它IAP家族，其表达TNFα/NFKB（肿瘤坏死因子α/核转录因子ΚB）信号转导途径的调控，可能与JAKSTAT途径有关［6］。Survivin抗凋亡作用已被研究证实，它不仅通过阻断线粒体细胞色素C释放，与下游凋亡效应因子Caspase3和Caspase7结合而对其活性产生直接抑制效应，还通过与纺缍体纤维的结合，间接抑制Caspase对纺缍体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞的完整性，从而抑制细胞凋亡［7］。另外，Survivin与细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4,CDK4）形成SurvivinCDK4复合体，释放出P21，而P21能进一步与线粒体caspase3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡［8］。本实验结果提示，HBL提取液通过抑制人肺癌SPCA1细胞Survivin mRNA和蛋白的表达，使原先受到survivin抑制caspase3和caspase7蛋白酶原活化，进而激活下游的级联蛋白，从而诱导细胞凋亡，但由于细胞凋亡是一个多系统、多阶段参与的复杂过程，HBL诱导SPCA1细胞凋亡的确切机理有待进一步研究。
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［1］ 涂 硕，韦 星，万福生，等.花边莲提取液对人肺癌SPCA1细胞增殖和凋亡的影响［J］.江西医学院学报，2005，45（5）：24.
［2］ Ambrosinig,G, Adida C ,Altieri DC,et al.A novel anti-apopotosis gene,Survivin,expressed in cancer and lymphomal［J］.Nat med,1997,3(8)：917.
［3］ Enari M,Sakahira H,Yokoyama H,et al.A caspase-activated Dnase that degrads DNA during apoptosis,and its inhibitor ICAD［J］.Nature,1998,391:43.
［4］ Tormanen ,Napankangas U.Expression of caspase-3,-6 and -8 and their relation to apoptosis in non-smail cell lung careinoma［J］.International jorunal of cancer,2001,93(2):192.
［5］ 王卫东.凋亡抑制因子Survivin的研究进展［J］.国外医学肿瘤分册，2001，28（4）：250.
［6］ 韩晓黎.SUVIVIN与肺癌［J］.临床肺科杂志，2004，9（4）：381.
［7］ Andrade F.Roy S,Nicholoson D.et al.Granzyme B directly and efficiently cleaves sereral downstreem caspase substrates:implication for CTLinduced apoptosis［J］.Immunity,1998.8(4)：451.
［8］ Suzuki A,Ito T,Kawano H,et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk 4 to resist Fasmediated cell death［J］.Oncogene,2000,19(10):1346.
