HPLC法测定肾炎舒片中人参皂苷Re的含量

【摘要】  肾炎舒片由人参、茯苓等十味中药材组成的中药复方制剂，是卫生部批准生产的三类新药。具有益肾健脾、利水消肿之功效。本文以君药人参为其定量指标，采用高效液相色谱法，选用C18柱和乙腈-0.05%磷酸溶液（99:400）为流动相，检测波长为203nm，流速：0.8ml/min，理论塔板数按人参皂苷Re峰应不得低于2500。其标准曲线为Y=17766834.51＋232952.30x r=0.9999在2.0～16.0μg范围内成良好线性，平均回收率（n=6）为97.34%，RSD1.5%。该方法灵敏度高，重现性好，结果准确、可靠。

【关键词】  肾炎舒片 人参皂苷Re含量 高效液相色谱法

 　　肾炎舒片由人参等十味中药材，经加工提取制成。用于脾肾阳虚型肾炎引起的浮肿、腰痛、头晕、乏力等症。人参是方中的君药，具有大补元气、助精养神的作用，且又为细贵药材。因此，我们采用高效液相色谱法对人参中的人参皂苷Re进行含量测定，作为其制剂内在质量控制的指标，方法简便，灵敏度高，重现性好。

    1  仪器与试药

    1.1  仪器  高效液相色谱仪LC-10AT（日本岛津）；检测器：紫外；数据处理：SPD-10A；天平：METTLER AE240（瑞士）。

    1.2  试药  人参皂苷Re对照品由药品生物制品检定所提供，批号：0754-9911，供含量测定用；乙腈为色谱纯。肾炎舒片、人参原料均由吉林鹿王制药有限公司提供。

    2  色谱条件

    　　色谱柱：Aichrom Bond AQ C18 5μm 4.6×250mm AI-04012822；柱温：40℃；流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（99：400）；流速：0.8ml/min；纸速：1mm/min；检测波长：203nm[1]；灵敏度：AUFS0.04；理论塔板数不得低于2500。

    3  对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液

    3.1  对照品溶液的制备  精密称取人参皂苷Re对照品10mg，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Re0.4mg的溶液，即得。

    3.2  供试品溶液的制备[2]  取装量差异项下的本品，除去包衣，研细，取粉末4g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿回流提取至提取液无色，弃去氯仿液，挥尽氯仿，加甲醇加热回流提取至提取液无色，收集甲醇液，蒸干。残渣用正丁醇饱和的水30ml使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次（20、20、20、15ml），合并正丁醇液，用3倍量氨试液振摇洗涤3次，弃去氨试液，合并正丁醇液，蒸干，残渣用水2～5ml溶解，装入D101漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次（20、20、20、15ml），合并正丁醇液，用3倍量氨试大孔吸附树脂柱（湿法装柱，内径1.5cm，长17cm，用水洗至无醇味，备用）上。先用水100ml洗脱，弃去洗脱液，继用20%乙醇100ml洗脱，弃去洗脱液，再用70%乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇定量转移至5ml容量瓶中，即得。

    3.3  人参阴性对照溶液的制备  取除去人参，其他成分按处方比例加入，照“肾炎舒片”制备方法制成阴性对照品，按“供试品溶液的制备”方法制成人参阴性对照溶液。

    4  检测波长的确定

    　　参照《中国药典》2005年版一部人参【含量测定】项下，选用203nm为其检测波长。

    5  系统适用性试验的考察

    　　依上述方法，由仪器给出的理论板数n=7318。该色谱条件下，样品可得到很好的分离，参照药典及实验，规定理论板数按人参皂苷Re峰计不低于2500。

    6  流动相的选择

    　　参照《中国药典》2005年版一部人参【含量测定】项下的流动相的比例，以人参皂苷Re色谱峰的保留时间及分离度为判定指标，经反复试验证实：乙腈-0.05%磷酸溶液（99:400）适合本法且分离效果较好，故定为本法的流动相。

    7  提取方法的选择

    　　曾参照《药典》2005年版一部人参【含量测定】项下的提取方法处理样品，上机后杂质峰多；后经反复实验采用本方法，杂质峰较少，分离度较好，利于含量测定。且经薄层结果显示，提取较彻底，故提取方法如前述。

    8  阴性对照溶液的测定

    　　为进一步考察实验设计及测定方法的可行性，吸取本液20μl注入液相色谱仪，按上述方法测定，结果表明人参阴性对照色谱图在人参皂苷Re相应的保留时间附近无干扰峰，证明本方法可行。

    9  稳定性试验

    　　分别精密吸人参皂苷Re对照品溶液，常温放置，每间隔一定时间以相同体积20μl（定量环）注入液相色谱仪中，依法测定，以人参皂苷Re峰面积为指标，测定其稳定性，结果见表1。表1     人参皂苷Re稳定性试验结果表明：在48小时内，人参皂苷Re在常温条件下均基本稳定。

    10  标准曲线制备

    　　精密吸取配制成不同浓度的人参皂苷Re（0.10、0.20、0.40、0.60、0.80mg/ml）的对照品溶液20μl（定量环），注入高效液相色谱仪中，测定。以各自的浓度（mg/ml）为横坐标、峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。表2    Re的标准曲线得回归方程：Y=17766834.51＋232952.30x  r=0.9999，由此确定人参皂苷Re的线性范围在2.0～16.0μg。

    11  精密度试验

    　　取相同浓度的人参皂苷Re，5次进相同的体积，变异系数均符合规定，表明仪器精密度良好，见表3。表3  Re的精密度试验结果

    12  重现性试验

    　　取同一批样品依法独立测定5次，RSD=1.9%，表明重现性良好，见表4。表4  重现性试验

    13  供试品的测定

    　　取上述“供试品溶液的制备”项下制备的溶液作为供试品溶液，备用。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，依法测定，即得。所测得人参皂苷总含量见表5。表5    肾炎舒片含量测定结果

    14  最低限量的确定

    　　如上表所示，6批样品的平均含量为0.13mg/片，考虑到原料药材本身含量变化及生产中的波动，仍取其含量平均值的80%为限度，暂定本品每片含人参皂苷Re（C48H82O18）不得少于0.10mg

    15  回收率测定

    　　采用加样回收测定法，按前文所述含量测定方法制备供试品溶液，进行HPLC法测定，结果见表6。表6      人参皂苷Re回收率测定结果表明：本法平均回收率人参皂苷Re 97.34%，RSD 1.5%，表明本法准确度较好，方法可行。

    16  讨论

    　　影响实验结果的因素：①在除去包衣时，注意既尽量要刮去包衣，又不能刮去药片本身。②在样品前处理中，要挥尽氯仿后再加甲醇，以免影响溶剂极性，影响杂质的除去。③样品前处理中，D101大孔树脂装柱应均匀，洗脱时，流速不宜过快，应控制为1.5ml/min。④D101大孔树脂上样前要洗至无醇味，上样时，样品不超过3ml，色带要窄。⑤定量转移时，要少量多次加溶剂（n≥3）。⑥进样时要用定量环，比较准确，避免人为误差。

【】
  [1] 中国药典[S]．2005，7．

[2] 中华人民共和国卫生部药典委员会，编．中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂[S]．第20册，129．