参龙煎剂对肺纤维化肺组织形态学影响的实验研究

【摘要】  　　目的：观察参龙煎剂对博来霉素致大鼠肺纤维化的防治作用。方法：将大鼠按照性别、体重随机分为空白组、模型组、泼尼松组（5.4mg/kg）、参龙煎剂低剂量组（生药量0.675g/ml）、参龙煎剂中剂量组（生药量1.2g/ml）、参龙煎剂高剂量组（生药量2.4g/ml）。按照BLM5mg·kg－1体重复制大鼠肺纤维化模型。24小时后给药，观察各实验组7天、14天、28天肺组织病理形态表达情况的变化。结果：参龙煎剂后模型大鼠肺部炎症浸润情况减轻、肺泡破损减轻、胶原沉积减少。结论：结果表明，证实了参龙煎剂能够改善肺纤维化的异常组织结构，使延缓肺纤维化的病程成为了可能。

【关键词】  肺纤维化 HE染色 Masson染色

　　肺纤维化是一组病因各异、表现相似的疾病谱，其病理主要表现为早期的炎症细胞浸润、肺组织损伤，晚期的细胞外基质及胶原沉积和肺组织结构的重塑[1]。许多研究表明，肺纤维化初期肺组织病改变以肺炎症浸润为主，大量的炎症细胞浸润，肺组织充血、肿胀，后期则以胶原纤维增生为主，大量胶原纤维代替正常组织，使肺组织破坏、功能丧失[2～3]。

　　本实验旨在观察参龙煎剂即通过补肺益肾、祛瘀通络法对肺纤维化作用机制进行探讨。通过对各组大鼠的一般状态、病理形态的比较来说明参龙煎剂对博莱霉素引起的机体系统脏器损伤和一般功能状态的损害有一定的保护作用。

　　1  资料

　　1.1  实验动物 

　　健康Wistar大鼠216只：雌雄各半，体重180～210g，由沈阳医学院动物实验中心提供（动物许可证号：SCXK（辽）2003-0016），按清洁级标准饲养。

　　1.2  实验药品 

　　盐酸平阳霉素（BLM）：哈尔滨博莱制药有限公司生产，国药准字：H23021807，批号06060201，8mg/支。参龙煎剂：辽宁中医药大学附属二院制剂室制备，主要成分由黄芪、沙参、当归、川芎、熟地、地龙、甘草等中药组成。醋酸泼尼松片：国药准字H12020698，产品批号051108。5mg/片，天津天药药业股份有限公司。

　　1.3  主要试剂及仪器

　　万能显微镜（日本  OLYMPUS 公司）BI-2000图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）；HE染色、Masson染色试剂（医药上海化学试剂公司）。

　　2  实验方法

　　2.1  动物模型制备 

　　参照Szapiel[4]方法，将大鼠麻醉，暴露气管，一次性注入BLM注射液（5mg·kg－1），左右旋转鼠板，使BLM注射液均匀分布于两肺，制成模型。

　　2.2  实验动物分组及给药方法 

　　实验动物按雌雄、体重分层随机分为6组，每组36只，每天灌胃一次，每周复查体重，调整给药量。共饲养4周，分别于7天、14天、28天3个时间点取材，每次处死12只动物。分组：正常对照组、模型组、泼尼松组（5.4mg/kg）、参龙煎剂低剂量组（生药量0.675g/ml）、参龙煎剂中剂量组（生药量1.2g/ml）、参龙煎剂高剂量组（生药量2.4g/ml）。正常组、模型组建模后第2日起每日予以1ml/kg生理盐水灌胃。其余各组按配好的药品以等容药品灌胃。

　　2.3  标本的制备
 
　　腹主动脉放血至死，剖开胸腔和颈部，分离气管和肺脏，取下肺叶，用冰盐水洗去血渣，剔除结缔组织，滤纸吸干。称重后，同时结扎右主支气管，从肺门部离断，右肺上叶用定量输液泵小心灌入含有1/1000DFFC4%多聚甲醛溶液在25cmH20压力下进行灌注固定，切成1.5×1.5×1cm3大小，30分钟后投入多聚甲醛溶液固定一周。取固定好的组织，在横颈最大处3mm后组织片，常规脱水，二甲苯透明，用自动石蜡包理机。切面4um的切片。备做HE、MASSON染色、光学显微镜下观察。

　　2.4  病理形态学定量分析 

　　用BI-2000图像分析系统对HE染色病理切片进行光密度（OD值）测定。扫描时将切片分为3个区域：肺泡腔内无组织结构，OD值最低，定为无染区，其面积代表肺泡腔的面积；细胞核的OD值最高，定为深染区，其面积反映炎症细胞浸润程度；细胞外基质和炎症渗出染色较细胞核浅，HE切片中为粉色或浅粉，定为浅染区，与肺泡炎阶段炎性水肿和渗出的区域基本一致，在模型晚期其面积主要反映细胞外基质沉积程度。将切片置于图像扫描分析仪显微镜下，在放大200倍条件下，每张切片分别从四周和中间随机选5个视野，测定深染区、浅染区和无染区所占的面积。

　　2.5  利用HE染色的病理切片，确定肺泡炎等级判定方法
病变程度确定根据Szapiel等[4]的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。利用HE染色的病理切片将肺泡炎分为四级：（－）无肺泡炎；（+）轻度肺泡炎，单核细胞浸润面积＜20%，结构正常。（++）中度肺泡炎受累面积＜20%～50%。（+++）重度肺泡炎，受累面积＞50%。

　　2.6  利用Masson氏三色染色的病理切片，确定肺纤维化等级判定方法

　　根据Szapiel等[4]的方法，分为四级：0级：无肺间质纤维化（－）；1级：轻度肺间质纤维化（+），病变范围局限在全肺20%以下；2级：中度肺间质纤维化（++），病变范围占全肺20%～50%，肺泡结构紊乱。

　　2.7  统计学方法 

　　统计数据应用SPSS11.0统计软件单因素方差分析（one Way Anova），统计结果用（x±s）表示。

　　3  实验结果

　　3.1  肉眼观察肺组织外观形态

　　正常组大鼠双肺呈淡红色，表面光滑，灌洗时弹性好，未见出血点。7天时，造纤维化模型各组均有明显增大，质地坚硬，颜色鲜红，并见肺组织轻度充血，表面出血点增加，以模型组最为严重。14天、28天后，模型组表现双肺体积略缩小，质地硬，颜色暗红，表面粗糙不平，可见小片状、凸凹不平苍白灶，灌洗时弹性减弱，表面出血点散在，并见瘀斑。参龙煎剂各组肺组织颜色粉红色，表面略粗糙，灌洗时弹性尚好，体积无明显缩小，偶见出血点。激素组肺组织呈粉红色，表面光滑，灌洗时弹性好。

　　3.2  肺组织病理形态观察

　　HE染色可见各造模组均有程度不等的肺泡炎，肺泡腔及肺间质内有不等的炎性细胞浸润，以巨噬细胞、淋巴细胞及少量的中性粒细胞为主，模型组最明显，而参龙煎剂中剂量组效果最好。（见图2）MASSON染色中造模各组肺间质、支气管壁和肺泡隔胶原染色中胶原纤维明显增多，以模型组最多。7天时胶原纤维主要分布于细小支气管及小血管周围，肺泡间质散在的胶原纤维，胶原纤维较短，尚未形成片状及束状；14天时，小气管、小血管胶原纤维明显增多，支气管偶见少量束状胶原纤维，肺间质胶原纤维呈束状或小片状分布；28天时，支气管、小支气管、小血管大量胶原纤维环绕，周围胶原增生并向肺间质延伸在间质沉积，呈片状、束状，但治疗组病变程度均要比模型组轻。

　　3.3  各组大鼠不同时间点HE切片深染区比较情况

　　结果显示：HE染色病理切片深染区面积代表炎性浸润：①正常组大鼠各个时间点的深染区面积明显小于其它各组。P＜0.05或P＜0.01；②模型组炎性浸润随时间的推移，逐渐减低，各个时间点都大于中剂量和激素组有明显的差异，P＜0.05或P＜0.01；③参龙煎剂各个剂量组深染区的面积也有逐渐减少的趋势，且以中剂量增加减少幅度最大，14天、28天与高剂量、低剂量有统计学意义P＜0.05，且与激素组效果相似；④各个时间点参龙煎剂各个剂量均呈量效关系趋势（见表1、图1）表1  各组大鼠不同时间点HE切片深染区比较（略）注：﹡P＜0.05 compared with N；﹡﹡P＜0.01 compared with N；﹟P＜0.05 compared with M；﹟﹟P＜0.01compared with M；﹠P＜0.05 compared with MD。

　　3.4  肺泡炎、肺纤维化分级比较（见表2）。表2 各个时间点肺泡炎及肺纤维化分级比较（略）

　　4  讨论

　　肺部的病理组织形态改变是最直观的疗效衡量标准。实验结果表明，模型组大鼠肺脏从外观可见明显的充血、水肿、瘀点瘀斑、肺组织明显增大、质硬，而参龙煎剂各组肺组织形态明显好于模型组。肺组织轻度充血、水肿，肺组织增大、质略硬。与激素组比较，色泽较深、较粗糙、较大。从光镜检测结果可见，模型组肺组织可见明显的炎症及纤维化的改变，早期大量炎性细胞浸润，肺组织大量充血、水肿；晚期，纤维化沉积。参龙煎剂组肺部病变程度显著减轻、病变范围局限。无论是外观还是光镜下的检测情况，均可见肺泡炎和纤维化，这证明了参龙煎剂对肺纤维化有积极的干预作用，从而表明了其可靠的治疗效果。

　　病理形态半定量分析，把切片从整体上进行平均炎症浸润程度、纤维化程度及正常肺组织面积来判定。经参龙煎剂治疗的大鼠的肺泡腔面积显著增加（即无染区增加）而代表肺泡炎的深染区面积和代表纤维沉积的浅染区面积明显减少，在各个时间点与模型组差异显著。

　　肺组织的等级资料分析，是对肺泡炎及纤维化个数判定的指标。通过分析，模型组多呈中、重度肺泡炎或纤维化改变，而参龙煎剂各个剂量组合激素组则多呈轻、中度肺泡炎或肺纤维化改变，与激素组比较无明显差异。通过这两种方法的分析，可能说明了参龙煎剂起到了抑制肺泡炎的加重，抑制了胶原纤维的沉积，减缓了肺纤维化的进程，减轻了肺纤维化的病变程度。

　　5  小结

　　目前，我们所采用的方法复制出的只是一种药物性肺纤维化，不论从发病机制还是疗效评价，都有一定的局限性，且样本较小，治疗时间短，还不能全面、充分的反映出临床上的错综复杂的情况。在今后，自发性动物疾病近似于人类疾病，所以要大力开展自发性动物模型的探寻工作。现在，中医药的治疗尚在初步阶段，并且有很好的前景，相信在今后我们能充分利用中医的优势来对自发性动物模型进行研究实验。

【】
  　　[1] Crystal RG,Bitterman PB,Rennerds letal .interstitial lung diseases of causes:disorders characterized by chronic inflammation of theolwer respiratory tract.N EI Jmed :1984,310:154～166.

　　[2] 赵洪文，彭 璐．肺纤维化大鼠BALF中细胞成分和肺组织病理的动态研究[J]．医科大学学报，1997，26（5）：463～466．

　　[3] 柴文戌，李永春，刘玉玲，等．博莱霉素大鼠致肺纤维化形态学变化的实验研究[J]．中国实验动物学报，2003，11（2）：77～80．

　　[4] Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893～899.

　　[5] O'Conno r CM,FitzGerald MX.Matrix metallop ro teinases andlung disease.Tho rax,1994,49(6):602.