黄芪多糖对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

              作者：隗义双 余嗣明 刘平 周乾坤

【摘要】  目的：研究黄芪多糖对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法：利用线栓法阻断大脑中动脉（MCAO）制作大鼠局灶性缺血再灌注脑损伤模型，并将实验大鼠随机分假手术组，模型组，黄芪多糖低、中、高剂量组，于再灌后第1天、第3天、第7天处死取材，检测各组大鼠脑组织含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）变化情况，辅以氯化三苯四氮唑（TTC）染色观察脑梗死灶变化情况。结果：与假手术组比较，模型组脑组织含水量及MDA含量显著升高，梗死灶体积显著增大，SOD值明显降低；与模型组比较，黄芪多糖各剂量组的脑含水量，MDA含量显著降低，SOD值显著增高，梗死范围也明显减小。结论：黄芪多糖可以通过降低脑组织含水量、MDA水平，升高SOD水平，对缺血脑损伤有一定的保护作用。

【关键词】  黄芪多糖 脑缺血再灌注损伤 脑含水量 SOD MDA

    Protective Effect of Astragalus polysaccharide on Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

    　　【Abstract】Objective:To study the protective effect of Astragalus polysaccharide on focal cerebral ischemia-reperfusion in jury in rats.Methods:The models of focal brain ischemia-reperfusion injury was prepared by middle cerebral artery occlusion(MCAO)in SD-rats.The rats were randomly divided into sham operation control group,model group,low,middle and high dose drug group,after treatment the brain water content and the level of SOD,MDA were measured at the first,third and seventh day after reperfusion.The range of cerebral inflarct was observed by TTC dyeing.Resuit:Compared with the sham operation control group,the brain water content and the level of MDA were significantly higher,and the level of SOD was significantly lower in model group.The brain water content and the level of MDA were significantly lower,and the level of SOD was obviously higher in low,middle,high dose groups than ones in model group.Conclusion:Protective effect of Astragalus polysaccharide on focal cerebral ischemia-reperfusion in jury in rats was remardable by reducing the brain water content and the level of MDA,and increasing the level of SOD.

    　　【Key words】Astragalus polysaccharide;Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury;SOD;MDA

    　　黄芪多糖（Astragalus polysaccharide,APES）是从传统中药黄芪中提取的具有较强生物活性的大分子化合物，对造血系统、心血管系统、免疫系统、物质代谢系统以及保肝护肾、抗病毒、抗肿瘤、抗应激等多方面具有药活性[1]。其对缺血脑损伤的影响作用，已经引起人们的重视。本实验通过线栓法制备大鼠局灶性脑缺血（MCAO）再灌损伤模型，研究黄芪多糖对缺血脑损伤中脑组织含水量、SOD、MDA含量的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  SD大鼠，雌雄各半，体重250～300g，购自安徽长临河医药科技有限公司（普通级）。

    1.1.2  药品与试剂  APES由博泰生物科技有限公司提供，纯度95%；SOD试剂盒（批号：20070414），MDA试剂盒（批号：20070416），考马斯亮兰蛋白试剂盒（批号：20070413）均购自南京建成生物工程研究所；水合氯醛（批号：20050613）上海五联化工厂；TTC（Amresco 07/2010）；直径0.26mm鱼线（日本PATU公司）。

    1.1.3  仪器  7200型紫外分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；冷冻离心机（3K30 sigma）；恒温培养箱（HPX-9272MBE 常州诺基仪器有限公司）；玻璃匀浆器（上海仪器二厂）。

    1.2  方法

    1.2.1  分组与给药  随机分为5组，分别为假手术组；模型组：黄芪多糖小、中、大剂量组；每组19只，药物组与手术后10分钟腹腔注射黄芪多糖（低0.5g·kg－1·d－1、中1g·kg－1·d－1、高2g·kg－1·d－1），由生理盐水配置，之后每天同样时间给药，模型组和假手术组在相应时间注射等体积生理盐水。分别与给药1天处死7只，3、7天各处死6只。

    1.2.2  大鼠MCAO再灌注模型制作  利用改良Longa法[2～3]制作MCAO模型：术前禁食12h但不禁水。大鼠以10%水合氯醛0.36ml/100g腹腔注射麻醉，麻醉后仰卧固定，颈正中切口，依次分离暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）、0-3号丝线分别结扎CCA远心端、ECA，微型血管夹夹闭ICA，在CCA处剪一小口，将头端烧制圆钝的鱼线沿CCA插入ICA，鱼线插入18.5～20mm处感觉有明显阻力后停止进线，结扎ICA，固定鱼线，缝合肌肉、皮肤，体外留2cm鱼线以备再灌。手术10min后腹腔注射黄芪多糖；缺血90mins后，轻轻拔出鱼线至遇到轻微阻力，实现再灌，剪去体外部分鱼线，待大鼠完全苏醒后进行神经行为学评分。假手术只分离CCA、ICA、ECA、腹腔注射等体积生理盐水。

    1.2.3  神经行为评分  Longa[2～4]5分制评分标准：0分无神经缺损症；1分提尾时对侧前肢内收，不能完全伸直；2分爬行时向对侧旋转、划圈；3分站立时向对侧倾倒；4分无自主活动伴意识障碍；5分死亡。1～4分符合实验要求，剔除不符合实验要求的并加以补充。

    1.2.4  脑组织含水量、SOD、MDA的测定  缺血再灌1天、3天、7天后分批处死迅速取脑，取右侧半脑二分之一用于脑含水量变化，称湿重于100℃烘箱内至恒重，脑含水量（%）=（湿重－干重）/湿重×100%。另二分之一制作脑匀浆，按照试剂盒说明书方法检测SOD、MDA。

    1.2.5  脑组织切片TTC染色观察  配置1%TTC磷酸缓冲液（pH7.4）；第一天处死的大鼠各组中取一只，迅速取脑放于－20℃冰箱中冷冻15min，切去嗅球和地位脑干，间隔2mm连续冠状切片6片，放入1%TTC磷酸缓冲液37℃避光染色30mins，10%福尔马林固定，拍照。

    1.3  统计学处理  数据以均数±标准差（x±s）表示，组间差异用SPSS统计软件进行方差分析。

    2  结果

    2.1  脑组织含水量变化  含水量测定结果见表1。表1 缺血再灌1天、3天和7天脑含水量变化情况注：VS假手术△P＜0.01；VS模型组*P＜0.05，**P＜0.01。

    2.2  各组大鼠脑组织SOD、MDA含量测定  SOD、MDA含量测定结果见表2、表3。表2   缺血再灌1天、3天和7天脑组织SOD含量变化情况注：VS假手术△P＜0.01；VS模型组*P＜0.05，**P＜0.01。表3 缺血再灌1天、3天和7天脑组织MDA含量变化情况注：VS假手术△P＜0.01；VS模型组*P＜0.05，**P＜0.01。

    2.2  大鼠脑组织切片TTC染色结果

    3  讨论与分析

    　　缺血性脑血管病是一种严重危害人类健康的疾病，缺血性脑血管病导致的偏瘫及认识功能障碍成为影响人类生存的最大保障，临床上大脑中动脉闭塞导致的脑缺血梗塞占了缺血性脑血管病的绝大部分[5]，局部脑缺血模型一般采用MCAO方法，因MCAO模拟的病例过程与临床脑卒中很相似，被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型[6～7]，故本实验采用线栓法制备局灶性脑缺血损伤模型。

    　　脑缺血再灌注损伤机制非常复杂，已知有许多因素参与再灌注损伤过程，如自由基、兴奋性神经递质效应、细胞内钙离子超载、一氧化氮、炎性介质损伤等[8～9]，目前认为自由基损伤在其中发挥着重要的作用[10～12]。与脑缺血有关的自由基主要是氧自由基，自由基主要攻击脂质膜中的不饱和脂肪酸的多个不饱和链，使之发生过氧化反应，导致质膜损伤，通透性增加，各种细胞器解体，加重细胞毒性水肿[13]；MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化间接地反应了脑组织中氧自由基含量的变化；SOD是一种带负电荷的金属蛋白酶，它通过歧化的方式清除超氧阴离子自由基，脑缺血及再灌时产生过多的自由基，消耗了大量的SOD，导致脑组织中含量下降[14～15]。因此可以通过测定脑组织含水量、MDA、SOD变化，间接的反应脑组织中自由基含量及脑组织损伤程度。本实验测定了各组实验大鼠1、3、7天的脑组织含水量、SOD、MDA含量变化情况。由实验结果可以看出，模型组的脑含水量、MDA含量明显高于假手术组，SOD含量明显低于假手术组；而各剂量药物组脑组织的含水量、MDA水平与模型组相比明显有所降低，SOD水平有明显提高，尤其是中剂量和高剂量组有极显著的变化。另外，TTC染色可以很好的显示损伤后脑组织的梗死状况[16]，由TTC染色结果也可以看出，APES治疗组梗死范围较模型组减少，中、高剂量组的梗死范围较小剂量组明显的减少。有报道[17～18]，局灶性缺血再灌注48～72h时损伤程度达到高峰。本实验的结果可以看出，缺血再灌第三天的MDA、脑含水量都高于第1、7天的测量结果，而SOD水平则低于第1、7天的测量结果，与报道基本相符。

    　　本实验表明，APES对大鼠局灶性缺血再灌注损伤脑组织有一定的保护作用，可以降低缺血再灌注组织MDA含量，提高SOD活性，抑制脂质过氧化和减轻脑水肿。其机制可能是通过有效清除脑组织中的自由基，减轻自由基的神经毒性，增强脑组织抗氧化能力，从而实现对脑组织的有效保护作用。

【文献】
  [1] 陈阿琴，杨志刚，俞颂东，等．黄芪多糖作用研究进展[J]．兽药杂志，2005，39（9）：33～36．

[2] Longa EZ,Westein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery ortery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84～91.

[3] 辛世萌，刘远洪，聂志余．栓线长度、直径以及大鼠体重与栓线法大鼠局灶性脑缺血模型关系的研究[J]．大连医科大学学报，2000，22（2）：105～107．

[4] 王引明，刘春风．线栓法制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型若干问题的探讨[J]．SZHU J Med Sci，2006，26（3）：392～395．

[5] 蒲小平，李长岭．脑缺血的细胞应答对研制新药的启示[J]．中药药学杂志，1999，34（9）：579～581．

[6] 李兵，章翔，蒋小帆，等．改良四血管阻塞法建立大鼠全脑缺血模型[J]．中华神经外科疾病研究杂志，2005，4（2）：110～113．

[7] 王伟．严格控制实验条件建立标准化脑制备动物模型[J]．中华神经科杂志，1998，31（5）：261．

[8] Roebuck KA.Oxidant stress regulation of L-8 and ICAM-1 gene expression differential activation and bingding of the transcription factors SP-1 and NF-κB.Int J Mol Med,1999,4(3):223～230.

[9] Kim Js,Gautam SC,Chopp M et al.Expression of Monocyte chemoattractant profent-lland macrophage inflammatory protein-1 after focal cerebral ischemia in the rat.Nerto immuel,1995,56(2):127～134.

[10] White BC,Sullivan JM,Degracia DJ,et al.Brain Isschemia and Reperfusion:Molecular Mechanisms of Neuronal Injury[J].J Neurol Sco,2000,179:1.

[11] Jiang MZ,Tsukahara H,Ohihima Y,et al.Effects of antioxidants and nitricoxide on FNF-alpha-induced anhesion molecule expression and NF-dappa B activation in human dermal microvascular endothelial cells[J].Life Sci,2004,75(10):1159～1170.

[12] 姜德华，金男革，玄云汉，等．大鼠急性局灶脑缺血再灌注脑组织MDA含量和NOS活性的变化[J]．临床神经病学杂志，2000，13：201．

[13] Simonian NA,Coyle JT.Oxidative Stress in neurodegenerative disease[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1996,36:83～106.

[14] 徐忠信，杨宏，钱桂利，等．急性脑缺血在灌注损伤钙离子与氧自由基作用研究[J]．中风与神经疾病杂志，1995，12（6）：331～333．

[15] 杨军，马传庚．赤芍总苷质量缺血性脑血管病作用及其机制[J]．安徽医科大学学报，2002，36（2）：164～165．

[16] Mathew KS,Mclaughn dp,Ziabaril H et al.Rapid quatification of ischemic injury and cerebroprotection in brain slicks using denditometric assessment of 2,3,5-triphenyletrazolium chloride staining.Neurosci methods,2000,102(6):43～51.

[18] Menziea SA,BetzAL,Hoff JT.Contributions of ions and albumin to the formation and resolution of ischemic brain edema[J].Neurosurg,1993,78(2):257～266.