中药对哮喘大鼠IL?13 mRNA和TNF?α mRNA表达及IgE含量的影响

                 作者：代继宏，王永红，周远大，何海霞 

【摘要】  目的：探讨中药对哮喘大鼠IL?13 mRNA和TNF?α mRNA表达及IgE含量的影响. 方法：Wistar大鼠，随机分为中药治疗组（n=8），空白对照组（n=8），哮喘模型组（n=8），利用卵白蛋白（OVA）及氢氧化铝制作大鼠哮喘模型，在雾化激发期，中药组用杏仁、甘草等中药制成的溶液雾化大鼠，其余组用生理盐水代替. 支气管肺泡灌洗液中细胞分类计数，采用免疫放射法、逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)半定量法分别检测各组大鼠血清和肺泡灌洗液(BALF)中免疫球蛋白E(IgE)含量以及肺组织IL?13 mRNA和TNF?α mRNA 表达. 结果：与空白对照组比较，哮喘模型组大鼠IgE含量、EOS计数、IL?13 mRNA和TNF?α mRNA的表达显著升高. 与哮喘模型组比较，中药治疗血清IgE的含量、IL?13 mRNA和TNF?α mRNA的表达明显降低(P<0.05). 结论：中药治疗可抑制IL?13和TNF?α mRNA合成，改善哮喘炎症状态.

【关键词】  哮喘；TNF?α；IL?13

    0引言

    哮喘是严重威胁公众健康的疾病，目前哮喘的病因、发病机制还不十分清楚，但是在许多哮喘患者和哮喘动物模型中已经证实在哮喘发病过程中，T细胞亚群(特别是Th1／Th2)功能失调在哮喘发病中有重要作用. 白介素?13(IL?13)和肿瘤坏死因子?α(TNF?α)分别是Th2和Th1效应细胞的细胞因子，在哮喘发病机制中，两者之间的不平衡是引起免疫球蛋白E(IgE)异常和哮喘发病的重要因素，即Th2细胞占优势的反应导致一系列由IgE介导的变应性炎症［1］. 前期研究证实，采用我国传统中医学中具有抗炎作用的中药材进行组合，并制作成溶液雾化哮喘模型大鼠，观察到有明显的治疗作用［2］. 我们探讨该制剂治疗支气管哮喘的效应、免疫学调控机制，为该制剂的临床应用提供理论基础和实验依据.

    1材料和方法

    1.1材料重庆市桐君阁药房提供杏仁、甘草、黄芩、芍药加苏子各9克水煎2次混和，浓缩、过滤、沉淀，取液装瓶，4℃冰箱保存备用. 重庆医科大学实验动物中心提供8～10周龄Wistar大鼠，雌雄不限，体质量100 g，随机分为3组，分别为中药组、哮喘模型对照组和正常对照组，每组8只.

    1.2方法参照Santing等［3］的方法，并进行了适当改进，具体如下：致敏：中药组和哮喘模型对照组大鼠均首先用新鲜配制的卵白蛋白(OVA) (Grade V, Sigma) 1 mg+氢氧化铝200 mg+生理盐水1 mL混悬液在大鼠两腹股沟、腹、前足跖，共4点作sc，每点0.2 mL，最后腹腔注射0.2 mL，l wk后重复上述注射1次. 正常对照组则用NS代替OVA进行上述注射. 激发：中药组和哮喘模型对照组大鼠置于20 cm×20 cm×15 cm的密闭容器中，由PARI BOY高频雾化器提供雾化动力，以10 g/L OVA(GradeⅢ)进行雾化吸入激发，每次雾化30 min，连续6 d. 正常对照组用NS代替OVA进行激发. 从激发1 d起对各组大鼠施以如下处理，中药组：用中药溶液雾化大鼠，20 min，2次/d，共7 d；哮喘模型对照组及正常对照组：用NS雾化大鼠，方法同中药组.

    1.2.1支气管肺泡灌洗及灌洗液中(BALF)细胞分类计数大鼠心脏采血法致死后，立即充分暴露颈部正中区域，蚊式钳分离气管，插入22G留置针，缝线固定，用冰浴生理盐水反复灌洗，共8次，每次1 mL，每次灌洗后立即回吸，将所有回吸液置于冰浴离心管中，待8次灌洗完成后立即进行离心，1000 r/min×10 min，弃上清，吸取细胞沉渣50 μL涂片、干燥固定、瑞氏染色，显微镜下1000×依据形态学特点按照中性粒细胞(Neu)、嗜酸性粒细胞(Eos)、淋巴细胞(Lym)、巨噬细胞(Mac)和上皮细胞（Epi）进行分类计数200个细胞，每张玻片计数2次，取平均值记录.

    1.2.2大鼠血清和BALF中IgE的测定全血离心(3000 r/min，10 min)，取血清0.5 mL注入Eppendorf管，用于血清IgE测定，取BALF 0.5 mL注入Eppendorf管，用于BALF中IgE测定. 采用免疫放射双抗夹心法测定血清和BALF中的IgE. 将待测标本按1∶21体积比进行稀释，并充分摇匀. 各编号管加入标准品(双管)或待测样品各200 μL，并各加抗?人IgE包被珠1粒，摇匀，45℃温育2 h；蒸馏水冼3~4次；每管加 125I?抗?人IgE 200 μL，室温(20±4)℃ 24 h；洗涤；测1 min的CPM值；以标准点为横坐标，CPM为纵坐标，对数做图，根据曲线待测物浓度；样品中总IgE浓度=测值×21.

    1.2.3大鼠肺IL?13 mRNA和TNF?α mRNA 表达按Trizol试剂盒要求提取肺组织总RNA. 将RNA逆转录成cDNA进行PCR扩增反应. 引物设计参照［4-5］: IL?13 Forward 5′?AGACC AGACT CCCCT GTGCA?3′, Reverse 5′?TGGGT CCTGT AGATG GCATTG?3′, 扩增片段123 bp; TNF?α Forward 5′?TTCTC ATTCC TGCTC GTGG?3′, Reverse 5′?TTTGG TGGTT CGCCT CCT?3′, 扩增片段203 bp；三磷酸甘油醛(GAPDH) Forward 5′?TTCAC CACCA TGGAG AAGGC?3′, Reverse 5′?GGCAT GGACT GTGGT CATGA?3′扩增片段236 bp. IL?13: 94℃ 4 min→94℃ 20 s→65℃ 40 s→72℃ 1 min, 共32个循环,最后72℃ 10 min. TNF?α: 94℃ 3 min→94℃ 30 s→54℃ 30 s→72℃ 30 s,共35个循环,最后72℃ 7 min. 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,对电泳条带进行吸光度值的半定量分析，以各标本mRNA条带的吸收度参数与内参基因条带的吸收度参数的比值做为该标本mRNA的表达参数.

    统计学处理：检测结果采用x±s表示，各组样本均数之间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD?t检验，采用SPSS 11.5统计软件包完成数据处理，以P＜0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1BALF中炎性细胞计数及分类哮喘模型对照组BALF嗜酸性粒细胞(Eos)比例与正常对照组和中药组比较有所增加,差异均有统计学意义(P<0.05)，而其他细胞计数在各组之间无统计学差异（表1）.表1哮喘大鼠BALF中炎性细胞计数比较

    2.2对哮喘大鼠血清和BALF中总IgE的影响哮喘模型对照组血清和BALF中IgE的含量均较正常对照组和中药组明显升高(P<0.05)，正常对照组和中药组之间无统计学差异. IL?13 mRNA和TNF?α mRNA表达哮喘模型组较正常对照组增高（P<0.05），而中药组较哮喘模型组降低（P<0.05，表2）. 表2哮喘大鼠血清和BALF中IgE含量和肺组织中IL?13 mRNA和TNF?α mRNA的表达的比较

    3讨论

    本研究结果显示，哮喘模型组大鼠血及BALF中IgE含量明显高于对照组及中药组（P<0.05），而其肺组织中IL?13 mRNA及TNF?α mRNA的表达亦明显高于其他两组，表明IL?13和TNF?α可能参与哮喘的发生，而中药治疗可调节机体免疫功能［4-7］，本实验所用中药通过抑制IL?13和TNF?α的mRNA合成，减轻嗜酸性粒细胞等炎症细胞的聚集浸润，有利于炎症消退. 我们参照祖国医学中治疗哮喘常用的方剂加味定喘汤，选用其中具有较强抗炎及免疫调节作用的几味中药材，杏仁、甘草、黄芩、芍药加苏子. 但是，当几种中药中的有效成分进入机体后，会进一步通过药物配伍发生反应. “药动学相互作用论”认为，方剂药物配伍引起的疗效变化，是通过方剂体内成分的血药浓度及其药动学参数的变化而诱导的. 但是，是何种成分或几种成分调节免疫细胞，并且具体调节的分子水平机制尚需进一步研究.

【】
  ［1］ 林嘉友. 超敏反应［A］//何维. 医学免疫学［M］．北京：人民卫生出版社，2005：301-308.

［2］ 代继宏，符州，迟磊. 雾化吸入加味定喘汤防治实验性大鼠哮喘的初步探讨［J］.医学信息，2005，18（3）：248-251.

［3］ Santing RE，Olymulder CG，Zaagsma J，et al. Relationships among allergen?induced early late phase airway obstructions, bronchial hyperreactivity, and inflammation in conscious, unrestrained guinea pigs［J］. J Allergy Clin Immunol，1994,93(6):1021-1030.

［4］ Articles R, Singh BB, Khorsan R, et al. Herbal treatments of asthma: A systematic review［J］. J Asthma,2007,44(9):685-698.

［5］ Li XM. Traditional Chinese herbal remedies for asthma and food allergy［J］. J Allergy Clin Immunol,2007,120(1):25-31.

［6］ Zhang B，Wan MB，Wang LT. Expression of TNF?α mRNA in liver tissue of rats with hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine［J］. World J Infect, 2007, 7(1):21-24.

［7］ 史恒军，梁军，侯军峰,等. 养阴抗毒散对X线照射小鼠T细胞亚群及红细胞黏附功能的影响［J］. 第四军医大学学报,2004,25(11)：1039-1041.