灯盏细辛有效组分的钙拮抗作用研究

【摘要】  　　目的 考察灯盏细辛有效组分的的钙拮抗活性。方法 采用45Ca跨膜内流测量技术与兔离体肠肌实验，观察了灯盏细辛中水提物和总黄酮的钙拮抗活性。结果 45Ca跨膜内流测量实验中，与空白对照组比较灯盏细辛总黄酮（0.25、1.0 g·L-1）均有明显的抑制钙离子内流作用（P＜0.05，P＜0.01），水提物浓度为1.0 g·L-1时无钙拮抗作用反而促进钙离子内流。兔离体肠肌实验中，与空白对照组比较水提物组（1.0 g·L-1）的频率，总黄酮组（1、0.5g·L-1）的频率及张力均有显著抑制作用（P＜0.05）。结论 灯盏细辛总黄酮有明显的钙拮抗作用，而其水提物的钙拮抗作用还有待进一步研究证实。

【关键词】  灯盏细辛；有效组分；钙拮抗作用;45Ca

    Abstract：Objective To investigate the Ca2+ antagonistic effect of active components from Erigeron breviscapus.Methods By  45Ca transmembrane influx method,observed the effect on voltage -dependent Ca2+ channel（VDC）in rat aorta about aqueous extract and the flavonoids.Moreover,by duodenum of rabbits in vitro,observed the effect about aqueous extract and the flavonoids on the shrink of intestines,which was excited by Ca2+.Results Compared with blank control group,the flavonoids (0.25,1g·L-1) showed a significant inhibition of Ca2+ influx(P＜0.05,P＜0.01),but aqueous extract(1g·L-1)promoted Ca2+ influx(P＜0.01).Moreover,aqueous extract(1g·L-1)could reduce the frequency of intestines shrink only,the flavonoids(0.5,1g·L-1)could reduce both the frequency and tension(P＜0.05).Conclusion The flavonoids had definite Ca2+ antagonism,there would need more experiments to verify whether the aqueous has Ca2+ antagonism.

    Key words:Erigeron breviscapus；active components；Ca2+ antagonism；45Ca

    灯盏细辛〔Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.〕，主要含有以灯盏乙素为主的黄酮、倍半萜等化合物。具有散寒解表，活血舒筋，止痛消积等功效。通过药理实验及临床应用发现其有扩张血管，减少血管外周阻力，改善大脑微循环及抗血小板凝集的作用，可用于血栓性疾病、心脑血管疾病等。而近年来关于灯盏细辛在青光眼视神经保护方面的研究报道越来越多［1～4］。且最近研究表明，钙通道阻滞剂能与细胞膜钙通道结合，减少钙离子内流，扩张血管，从而改善视盘血供，阻断视网膜神经节细胞凋亡，起到视神经保护作用，在青光眼的治疗方面具广阔的应用前景［5］。另有人报道灯盏花素能抑制NA引起的Ca2+浓度升高［6］。基于这一情形，本研究采用45Ca同位素示踪技术［7］和兔离体肠肌收缩实验［8］，主要考察了灯盏细辛中水提物和黄酮类成分的钙拮抗活性，并为其视神经保护作用的机理探讨提供。

    1  材料和方法

    1.1  动物

    SD大鼠一级，体重(220土10)g，♀♂兼用。合格证号：川实动管第11号；日本大耳白兔，♀♂兼用，体重约2 kg，合格证号：医动字第（241031130）。均由成都中医药大学实验动物中心提供。

    1.2  药品及试剂

    灯盏细辛水提物、总黄酮由成都中医药大学民族医药研究所提供。45CaCl2(74 MBq·mL-1)，英国Amersham公司，批号：031201。盐酸维拉帕米注射液：上海禾丰制药有限公司产品，批号：040601。

    PSS溶液［7］；高钾PSS溶液（mmol·L-1）：NaCl 40、KCl 100，余同PSS溶液；无Ca2+-EGTA洗涤液：EGTA 10 mmol·L-1，余同PSS溶液（无CaCl2）。皆用重蒸水配制，pH 7.4。甲苯闪烁液：PPO 5 g、萘60 g、乙二醇乙醚300 ml加甲苯至1000 m1。

    台氏液组成［9］（g·L-1）：CaCl2 0.2,NaCl 8.0,KCl 0.2,MgSO4·7H2O 0.26,NaH2PO4·2H2O 0.065,NaHCO3 1.0,葡萄糖1.0。无钙台氏液：按正常台氏液中去掉CaCl2。CaCl2溶液（自配）。

    1.3  仪器

    FJ-2107P液体闪烁计数器，国营二六二厂生产。肌张力传感器，型号JH-2，北京，航天医学工程研究产品。BL-410生物信号系统，成都泰盟科技有限公司。

    1.4  方法

    1.4.1  45Ca同位素技术  击晕大鼠取出胸主动脉，剪成5～6 mm节段环，将动脉环置PSS液中保温1h后，依次移动脉环到含受试药与 45Ca（37 MBq·L-1）PSS液、受试药与 45Ca（37 MBq·L-1）高钾PSS液中平衡20 min，以上骤都在37 ℃，连续通O2条件下进行。然后将动脉环移入0～2 ℃无钙EGTA中洗涤1h，用滤纸吸干称重后，分别放入测量瓶中，加入体积分数为0.70的HClO4 25 μl和0.30的H2O2 50 μl，80 ℃消化20 min，冷却后加入甲苯闪烁液4 ml，放置2 h，用液体闪烁计数器测量放射性并dpm（每分钟衰变数），动脉环Ca2＋内流量由以下公式确定：

    Ca2＋内流量（μmol·kg-1）＝［动脉环 45Ca活度（dpm）/动脉环重量（kg）］［溶液Ca2＋浓度（mmol·L-1）/溶液中 45Ca浓度（dpm·mL-1）］

    1.4.2  离体肠肌实验  根据预试结果确定CaCl2溶液的终浓度为0.80 mmol·L-1，阳性药（维拉帕米）终浓度为2.5 mg·L-1，各受试药终浓度：水提物和总黄酮的高、低剂量均为1g·L-1、0.5g·L-1。

    取兔击其枕骨部致死，迅速剖腹，取十二指肠，剪去肠系膜，将肠管剪成约2 cm的小段，轻轻压出肠内容物，置于盛有台氏液之器皿中备用。将肠管两端各穿一线，其中一端固定于浴槽挂钩上，另一端悬吊于张力传感器的力臂上。浴槽内的无钙台氏液保持38土0.5℃，浴槽容积保持于50 ml，营养液与氧气发生装置相连，气泡控制为1～2个/秒。将肠肌固定待稳定后，加入CaCl2溶液0.5 ml并记录15min作为空白对照组曲线；漂洗2～3次，加入CaCl2溶液0.5 ml即时记录5 min，加入阳性药并记录10min。各受试药均按以上步骤进行试验，且各剂量重复做6个样本。

    1.4.3  统计学方法  实验数据采用单因素方差分析，应用SPSS 12.0进行处理。

    2  结果

    2.1  45Ca同位素技术

    灯盏细辛两组分对大鼠胸主动脉电压依赖性钙通道Ca2+内流量的影响见表1。表1  灯盏细辛各组分对电压依赖性钙通道从表中可看出，总黄酮0.25，1g·L-1有明显的钙拮抗作用，水提物1g·L-1反而有激动作用。

    2.2  离体肠肌实验

    以给药前5min内与给药后1 min内及8 min内的收缩幅度和频率为指标，结果见表2。表2  灯盏细辛对兔离体肠肌收缩的频率和张力的影响结果表明，灯盏细辛水提物1g·L-1、总黄酮1g·L-1、0.5g·L-1均能不同程度的对抗钙离子引起的肠肌收缩。其中水提物仅对给药后1分钟内肠肌收缩的频率有抑制作用，对张力无明显影响；总黄酮对给药后8min内肠肌收缩的频率及张力均有明显抑制作用，且作用时间较长。

    ３  讨论

    本实验研究发现灯盏细辛总黄酮具有确切的钙拮抗作用，但其水提物的钙拮抗活性在两类实验中未得到一致的结果，还需要进一步的实验研究确认。

    血管平滑肌上存在三种钙通道：溢流（Leak）钙通道、电压依赖性钙通道（VDC）、受体操纵性钙通道（ROC）。高钾引起平滑肌细胞去极化，导致VDC开放时，Ca2+内流量最强且较稳定［7］。因此，研究灯盏细辛中各组分对大鼠胸主动脉VDC Ca2+内流量的影响，对筛选出具钙拮抗活性的有效组分有重要意义。

    灯盏细辛广泛应用于心脑血管疾病的，而目前有实验及临床研究证实其具有一定的青光眼视神经保护作用。它的视神经保护作用是否与其钙拮抗活性有关，还有待更进一步的探讨。

【】
  ［1］朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛注射液对鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响［J］．中华眼科杂志，2000，36（4）：289－291.

［2］张艺，盛艳梅，孟宪丽，等.灯盏花单体成分对体外培养大鼠视网膜神经细胞的影响［J］．中药杂志，2005，30（11）：11－13.

［3］朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛对高眼压鼠视网膜神经节细胞超微结构的影响［J］．湖南中医杂志，2000，16（3）：71－72.

［4］张李蓉.灯盏花素液联合复方丹参液治疗眼底病观察［J］．云南中医中药杂志，2000，21（5）：23－24.

［5］孙琳琳.钙通道阻滞剂治疗原发性青光眼的作用机制［J］．海军医学杂志，2000，21（2）：89－90.

［6］雷开键，吴芹，石京山，等.灯盏花素对血管收缩的效应与细胞内游离钙的关系［J］．中国药理通讯，2003，20（1）：29.

［7］杨远友，刘宁，丘明丰，等.用45Ca同位素示踪技术研究瓜蒌皮具钙拮抗作用的活性成分［J］．核技术，2002，25（5）：345－8.

［8］张大方，孟宪丽，王清和，等.药理与中药药理实验［M］．上海：上海技术出版社，2002.

［9］陈奇.中药药理研究方法学［M］．北京：人民卫生出版社，1993.