ＭＲＳＡ-ＰＢＰ２ａ单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立
来源：岁月联盟
时间：2010-07-11
【关键词】 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，ＭＲＳＡ）是全球性引起内感染最重要的耐药致病菌之一［１，２］，对常用的包括甲氧西林在内的多种抗生素广泛耐药，其主要耐药机制是由于染色体ｍｅｃＡ基因［３］编码产生了对β-内酰胺类抗生素低亲和力的青霉素结合蛋白２ａ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ，ＰＢＰ２ａ）所致，由于其所致感染病情复杂、棘手、死亡率高，因此建立快速、准确地诊断ＭＲＳＡ感染的方法成为各国学者关注与研究的的热点。Ｎａｋａｔｏｍｉ和Ｓｕｇｉｙａｍａ［４］于１９９８年报道一种快速检测ＭＲＳＡ的乳胶凝集试验（Ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＬＡＴ），其原理是抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体致敏的乳胶颗粒与ＭＲＳＡ的膜蛋白提取物作用，如产生肉眼可见的凝集颗粒，证实有ＰＢＰ２ａ存在，以此判断该菌为ＭＲＳＡ。目前该方法国外已有试剂盒出售［５］，但尚无具有自主知识产权的国产试剂盒问世。本研究利用自行制备的针对ＰＢＰ２ａ的单克隆抗体，以化学交联法致敏羧化聚苯乙烯乳胶，对致敏条件进行探索和优化选择，建立了检测ＰＢＰ２ａ的乳胶凝集法，旨在为进一步制备ＭＲＳＡ快速鉴定试剂盒奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材 料
ｐＥＴ-ｈｉｓ-ＰＢＰ２ａ转肽酶区表达质粒由本室构建，Ｎｉ-ＮＴＡ金属鳌合亲和层析柱为Ｎｏｖａｇｅｎ公司产品。１００ ｇ／Ｌ羧化聚苯乙烯乳胶为上海科欣生物公司产品；水溶性碳化二亚胺（ＥＤＣ）购自Ｓｉｇｍａ公司，－２０ ℃保存。其余试剂为分析纯。高速冷冻离心机为ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ公司产品；７１７０全自动生化分析仪为日立公司产品。
１．２ 方 法
１．２．１ 重组ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白制备
取含ｐＥＴ-ｈｉｓ-ＰＢＰ２ａ转肽酶区表达质粒的Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ于含氨卞青霉素（１００ ｍｇ／Ｌ）ＬＢ培养液中３７ ℃ ２５０ × ｇ振摇至Ａ６００ｎｍ＝０．６，加ＩＰＴＧ（终浓度为０．６ ｍｍｏｌ／Ｌ）于３７ ℃继续振摇培养５ ｈ，离心收集菌体，８ ｍｏｌ／Ｌ的尿素变性后，过Ｎｉ-ＮＴＡ金属鳌合亲和层析柱，以ＳＤＳ-ＰＡＧＥ鉴定重组蛋白相对分子量（Ｍｒ）及纯度，并采取逐步降低尿素浓度梯度复性法复性，离心取上清，ＰＥＧ（２００００）浓缩后备用［６］。
１．２．２ 抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体的制备
以重组ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白为抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和ＮＳ-１骨髓瘤细胞在ＰＥＧ（４０００）作用下进行细胞融合，筛选和４次克隆化，获得２株特异性好、亲和力高、可稳定分泌抗ＰＢＰ２ａ ｍＡｂ的杂交瘤细胞。取其中１株杂交瘤细胞（１ × １０６）接种于已注射降植烷的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔中制备腹水，采用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水中抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体。取０．５ ｍＬ小鼠腹水用ＶＢＳ缓冲液稀释至２ ｍＬ，混匀后加入３０ ｍｇ ＳｉＯ２，置于室温中搅动３０ ｍｉｎ，４ ℃ １４ ０００ × ｇ离心１５ ｍｉｎ。取上清加入８ ｍＬ醋酸缓冲液，在缓慢搅拌过程中，室温下逐滴滴加正辛酸３３ μＬ，使其终浓度为３．３％，４ ℃，１４ ０００ × ｇ离心１５ ｍｉｎ；取上清用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ调ｐＨ至７．０；再加入ＰＢＳ（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）６ ｍＬ以及４５％硫酸铵溶液６ ｍＬ，４ ℃，１４ ０００ × ｇ离心１５ ｍｉｎ；弃上清，取沉淀加入适量ＰＢＳ，装于透析袋内，对５０倍体积的ＰＢＳ（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４）４ ℃，透析２４ ～ ４８ ｈ，中途换液数次。将透析物进行蛋白量的测定，并于４ ℃保存［７］。
１．２．３ ＰＢＰ２ａ乳胶凝集法的建立
①致敏方案［８］：取０．４ ｍＬ的羧化聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入１ ｍＬ碳酸缓冲液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ９．６）１４ ０００ × ｇ离心１０ ｍｉｎ，倾去上清液，反复洗３遍，再加入１ ｍＬ ＰＢＳ溶液１４ ０００ × ｇ离心１０ ｍｉｎ，倾去上清液，反复洗３遍，接着加入水溶性碳化二亚胺（ＥＤＣ）０．５ ｍＬ和ＰＢＳ ０．５ ｍＬ，室温下搅动３０ ｍｉｎ，再用硼酸缓冲液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ８．０）１４ ０００ × ｇ离心１０ ｍｉｎ，倾去上清液，反复洗３遍。再加入１ ｍＬ硼酸缓冲液制成胶乳悬液，再加入提纯的抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体０．１ ｍＬ，室温下于摇床上摇动适当时间。最后加入终止剂甘氨酸溶液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ） ５０ μＬ，搅动３０ ｍｉｎ，１４ ０００ × ｇ离心１５ ｍｉｎ，收集上清液进行蛋白量测定。最后将已致敏胶乳试剂悬浮于贮存液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４的ＰＢＳ溶液，５％甘油，０．０１％ ＢＳＡ，０．１％叠氮钠）中４ ℃保存。②致敏乳胶试剂与重组蛋白ＰＢＰ２ａ的反应：用移液器吸取２５ ～ ３０ μＬ抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体致敏的乳胶试剂滴于黑色卡片上，然后吸取等量的重组蛋白ＰＢＰ２ａ与卡片上的乳胶试剂混合，并用枪头搅拌均匀，轻轻摇动卡片，使其充分结合，５ ～ １０ ｍｉｎ后判定结果。同时用生理盐水设为阴性对照。③结果判定：“＋＋＋＋”表示：全部胶乳凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“＋＋＋”表示：大部分胶乳凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“＋＋”表示：约５０％胶乳凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“＋”表示：有少许凝集，液体呈混浊；液滴呈原有的均匀乳状而不凝集则为“－”。④抗体偶联效率的测定［９］：抗体偶联效率通过反应前后溶液中的蛋白量变化求得：偶联效率（％） ＝ （ＰＢＰ２ａ单克隆抗体的初始加入量－ 剩余上清液中的ＰＢＰ２ａ单克隆抗体蛋白量）／ ＰＢＰ２ａ单克隆抗体的初始加入量 × １００％。蛋白量经７１７０全自动生化分析仪测定。⑤最佳偶联时间的选择：在抗体浓度（１４０ ｍｇ／Ｌ）和ＰＢＳ缓冲液ｐＨ为５．８的条件下，分别用１０ ｇ／Ｌ、１５ ｇ／Ｌ、２５ ｇ／Ｌ、５０ ｇ／Ｌ的羧化乳胶，分别在反应后２ ｈ、４ ｈ、６ ｈ、８ ｈ、１０ ｈ、１２ ｈ观察凝集效果和测定抗体偶联效率，选择最佳偶联时间。⑥最佳偶联缓冲液ｐＨ值的选择：采用了３个不同ｐＨ值的ＰＢＳ溶液分别是：５．８（偏酸性）、６．８（中性）、８．０（偏碱性）用于致敏乳胶试剂。通过凝集效果的观察，选择最佳偶联缓冲液的ｐＨ值。⑦最佳偶联羧化聚苯乙烯乳胶浓度的选择：将提纯的ＰＢＰ２ａ单克隆抗体分别偶联５个不同浓度的羧化聚苯乙烯乳胶，通过凝集效果的观察和抗体偶联效率的测定，选择最佳偶联羧化聚苯乙烯乳胶浓度。⑧最佳偶联ＰＢＰ２ａ单克隆抗体蛋白量的选择：分别用３个不同浓度的ＰＢＰ２ａ单克隆抗体偶联一定浓度的羧化聚苯乙烯乳胶，通过凝集效果的观察和抗体偶联效率的测定，选择最佳偶联ＰＢＰ２ａ单克隆抗体蛋白量。
１．２．４ 致敏乳胶试剂质量的鉴定
①自凝性：用等量ＰＢＳ、硼酸缓冲液、生理盐水分别代替待检样品，观察致敏胶乳的会否自凝。②敏感性：将重组蛋白ＰＢＰ２ａ进行一系列浓度的倍比稀释，分别用致敏好的乳胶诊断试剂检测，观察其凝集程度。③特异性：将致敏好的乳胶试剂分别与重组ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白、ＢＳＡ、ＭＲＳＡ、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌进行检测，观察其特异性（ＭＲＳＡ临床分离株经自动药敏仪器、进口乳胶凝集鉴定试剂盒及ｍｅｃＡ基因ＰＣＲ检测法鉴定证实为甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌）［１０］。④可重复性：在上述致敏条件确定的基础上制备３批ＰＢＰ２ａ胶乳试剂，每批５个，在每批胶乳试剂中随机抽取３个对重组蛋白ＰＢＰ２ａ进行检测，观察重复性。
２ 结 果
２．１ 抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体的制备
鼠源性ＰＢＰ２ａ单克隆抗体经７１７０全自动生化分析仪测定蛋白量为１４０ ｍｇ／Ｌ。
２．２ 偶联时间对致敏效果的影响
在抗体浓度（１４０ ｍｇ／Ｌ）和ＰＢＳ缓冲液ｐＨ为５．８的条件下，偶联时间对抗体和羧化乳胶偶联效率的影响如图１所示。结果表明偶联时间为８ ｈ时偶联效率及凝集程度最佳。
２．３ 偶联缓冲液ｐＨ值对凝集效果的影响
试验中采用了３个不同ｐＨ值的ＰＢＳ溶液与ＥＤＣ交联剂反应，用于致敏乳胶试剂，分别是：５．８（偏酸性），６．８（中性），８．０（偏碱性）。当致敏乳胶的ＰＢＳ溶液的最佳ｐＨ值为５．８时凝集程度最佳，且致敏后乳胶不发生自凝。
２．４ 最佳偶联羧化聚苯乙烯乳胶浓度的选择
根据前面述及的致敏方案，在８ ｈ的偶联时间条件下，使用ｐＨ为５．８的ＰＢＳ缓冲液，将５个不同浓度的乳胶分别与提纯的ＰＢＰ２ａ单克隆抗体进行偶联，结果如表１所示。经试验证明，乳胶浓度为１５ ｇ／Ｌ时偶联效率最高，凝集效果最佳。
２．５ 最佳偶联ＰＢＰ２ａ单克隆抗体蛋白量的选择
根据前面述及的致敏方案，在８ ｈ的偶联时间条件下，使用ｐＨ为５．８的ＰＢＳ缓冲液，３个不同浓度的ＰＢＰ２ａ单克隆抗体分别与１５ ｇ／Ｌ的乳胶进行偶联，结果如表２所示。经试验证明，ＰＢＰ２ａ单克隆抗体浓度为１４０ ｍｇ／Ｌ时偶联效率最高，凝集效果最佳。
２．６ 胶乳凝集抗原质量的鉴定
２．６．１ 敏感性试验
如表３所示。结果表明，乳胶试剂敏感性可达０．０１ ｍｇ／Ｌ。
２．６．２ 自凝性
致敏乳胶与重组ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白凝集呈阳性（＋＋＋），与等量ＰＢＳ、硼酸缓冲液、生理盐水分均呈阴性反应（－）。
２．６．３ 特异性
结果表明，致敏乳胶试剂能够与纯化的ＰＢＰ２ａ转肽区蛋白、ＭＲＳＡ菌体蛋白提取液 发生明显的凝集反应，而与ＢＳＡ、铜绿假单胞菌裂解液、大肠杆菌裂解液、表皮葡萄球菌的裂解液不发生凝集，其特异性良好。
２．６．４ 可重复性
可重复性试验结果见如表４所示。
３ 讨 论
乳胶凝集试验是一种快速、操作简便的免疫学诊断方法，在临床快速诊断领域有着广阔的应用前景［１１］。化学交联法是乳胶致敏技术中最重要和最常用的方法之一。该法是利用化学胶乳表面的羧基、羟基或酰胺基团通过化学交联剂与抗原（或抗体）上的氨基基团进行共价连接，即在化学乳胶的功能基团上通过化学交联剂接一个手臂，这样既可减轻空间构型对抗原抗体反应的阻碍，还可降低对致敏抗原（或抗体）的纯度要求。此法致敏的乳胶在特异性、稳定性、和敏感性上相对普通的物理吸附法来说有一定程度的提高，因此在近些年得到了较为广泛的应用［１２］。
我们在自行制备了ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白及其单克隆抗体的基础上，进行了ＰＢＰ２ａ乳胶凝集检测法的建立。在试验中对抗体浓度、乳胶浓度、偶联时间、偶联关键缓冲液ＰＢＳ的ｐＨ值等因素进行了探索和优化。发现乳胶凝集效果与下述因素有关：偶联过程中蛋白的加入量、偶联时间和乳胶的浓度。结果表明，１４０ ｍｇ／Ｌ的抗体浓度与１５ ｇ／Ｌ以及２５ ｇ／Ｌ的乳胶浓度均有较好的凝集效果，偶联效率也较高，随着加入抗体浓度的下降，致敏效果减弱，偶联效率下降。考虑成本因素，确定最佳致敏的抗体浓度为１４０ ｍｇ／Ｌ，乳胶浓度为１５ ｇ／Ｌ。浓度为５ ｇ／Ｌ的乳胶与抗体偶联的乳胶试剂与抗原蛋白不能发生凝集效果，说明乳胶浓度过低，蛋白的吸附量降低，乳胶试剂的敏感性降低，偶联不易实现。随着时间的增加，偶联效率不断增加，在偶联时间８ ｈ左右，偶联效率最高，８ ｈ后，偶联效率趋于下降。因此，８ ｈ为最佳的偶联时间。对３种不同ｐＨ值的ＰＢＳ溶液的比较中，当ｐＨ值达到中性（ｐＨ ６．８）及碱性（ｐＨ ８．０）时，乳胶试剂无法和ＰＢＰ２ａ抗原发生凝集。因此确定ｐＨ＝５．８的偏酸性的ＰＢＳ缓冲液为最佳的偶联缓冲液。这是因为碳化二亚胺（ＥＤＣ）活化羧基基团的反应需在酸性条件下（ｐＨ＜７）进行［１３］，但是免疫球蛋白分子在酸性太强的条件下易丧失活性，因此选择５．８的ｐＨ值对抗体致敏是必要的。另外，ＥＤＣ是一种性质非常活跃的试剂，在储藏和使用中应避免高温、潮湿。
上述条件优化后对致敏乳胶试剂进行了质量鉴定，所制备的致敏乳胶试剂在ＰＢＳ、硼酸缓冲液、生理盐水中均不出现自凝，不仅能与重组ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白呈现良好的凝集反应（敏感性达０．０１ ｍｇ／Ｌ），而且与临床分离的ＭＲＳＡ菌株也呈现良好的凝集反应，并与ＢＳＡ、铜绿假单胞菌裂解液、大肠杆菌裂解液、表皮葡萄球菌裂解液不呈现凝集反应，表明所建立的ＰＢＰ２ａ乳胶凝集检测法具有良好的特异性和敏感性，为进一步大批量的临床验证奠定了基础。重复性试验结果显示本试验有待进一步提高其稳定性，其原因可能在于一些试剂加入量的误差，以及批间重复实验中的操作误差。乳胶试剂的保存液和保存时间也有待进一步摸索。
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