HPLC法同时测定丹参类药材中水溶性活性成分的含量

                   作者：杨树声,宋平顺，赵建邦 ，丁永辉

【摘要】  目的建立HPLC法同时测定丹参和甘肃丹参中丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B含量的方法，通过3种水溶性活性成分测定，评价野生和甘肃栽培丹参、野生和栽培甘肃丹参的质量。方法 色谱柱为C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇—冰醋酸—水（20∶80∶1）；流速1.0 mL/min。二元梯度洗脱。结果 丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B分别在58～1455 ng、15～162 ng、825～8250 ng范围内线性关系良好，回收率分别为102.20 %、101.53 %和103.03 %。结论 方法简便、准确、分离效果好，可作为丹参水溶性活性3种成分的同时定量测定方法。

【关键词】  高效液相色谱法；丹参；甘肃丹参；水溶性成分；丹参素钠；原儿茶醛；丹酚酸B；栽培；野生

    丹参《药典》收载为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的根[1]，甘肃分布于天水、陇南地区，仅有资源而无商品，近年，庆阳、平凉等地人工栽培成功。甘肃丹参来源于唇形科植物甘西鼠尾草Salvia przewalskii Maxim. 或变种褐毛甘西鼠尾草Salvia przewalskii var. mandarinonum (Diels) Stib.的干燥根及根茎，分布于甘肃、四川、云南等省区，为中药丹参的地方习用品，在甘肃药用较久，清代地方志已有收录[2]，亦在定西、平凉等地种植成功。甘肃人工栽培的丹参、甘肃丹参的质量研究评价未见报道，笔者建立了HPLC法同时测定丹参中丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B含量的方法，通过3种水溶性活性成分测定，评价野生和甘肃栽培丹参、野生和栽培甘肃丹参的质量，为今后甘肃人工资源和选择GAP适宜的基地提供依据。

    1仪器与试药

    1.1仪器

    美国Waters515型泵，Waters717自动进样器，Waters2487型紫外检测器。超声波清洗器KQ2500（昆山市超声仪器有限公司）。

    1.2  试药

    丹参素钠（110855-200203）、原儿茶醛（810-20004）、丹酚酸B（111562-200504）由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定。甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

    甘肃丹参实验材料为甘西鼠尾草Salvia przewalskii Maxim. 的根茎，野生品分别产于漳县、天水、华亭、临夏、渭源等县，栽培样品产于岷县、渭源县；丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的根，栽培样品产于华亭县和市售1，野生品为市售2；以上经作者严格鉴定。

    2方法与结果

    2.1  色谱条件

    大连伊利特C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）。流动相为甲醇—冰醋酸—水（20∶80∶1），二元梯度洗脱，0～5 min，甲醇10 %；5～25 min，甲醇10 %～35 %；25～45 min，甲醇35 %。流速1.0 mL/min；检测波长280 nm。进样量10 μL。柱温45 ℃。理论板数按原儿茶醛峰应不低于2000。

    2.2含量测定

    2.2.1对照品溶液的制备

    精密称取丹参素钠5.82 mg、原儿茶醛3.67 mg、丹酚酸B 8.25 mg对照品，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定溶制成对照品储备溶液。

    2.2.2  供试品溶液的制备

    取样品（过3号筛）0.5 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，精密加水50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

    对照品溶液、供试品溶液的HPLC色谱图见图1、图2。

    图1对照品HPLC图

    1.丹参素钠2.原儿茶醛3.丹酚酸B

    图2供试品HPLC图

    2.2.3线性关系考察

    分别精密称取1 mL丹参素钠、1 mL原儿茶醛、1 mL丹酚酸B对照品储备溶液，分别置于100 mL、250 mL和5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀。分别选择1,5,10,15,25 μL和1,3,5,7,11 μL以及5,10,20,40,50 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以进样量（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，其线性方程分别为：X= 1.8208×10-3Y-0.1124、ｒ=0.9999；X=1.9078×10-4 Y-0.0171、ｒ=0.9991；X=1.0745×10-6 Y-1.8053、ｒ=0.9998；结果分别在58～1455 ng、15～162 ng 和825～8250 ng范围内线性关系良好。

    2.2.4精密度试验

    对同一批甘肃丹参样品（临夏）按“供试品溶液制备”方法，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，重复进样5次，结果峰面积RSD分别为1.85 % 、1.27 %和1.01 %。

    2.2.5  稳定性试验

    对同一批甘肃丹参样品（临夏）按“供试品溶液制备”方法，分别于配后0，2，4，6，8 h，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。结果表明，丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B在12 h内基本稳定，RSD分别为2.56 %、2.76 %和2.14 %。

    2.2.6重复性试验

    对同一批甘肃丹参样品（临夏）按“供试品溶液制备”方法，取5份制备，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B的含量，分别为0.0513 %、0.0150 %和3.5001 %，RSD分别为2.57 %、2.70 %和2.18 %。

    2.2.7回收率试验

    取已知含量的同批样品0.25 g（产临夏，丹参素钠、原儿茶醛的含量分别为0.0513 %、0.0150 %、3.5001 %） 6份，精密称量，分别精密加入对照品储备溶液3 mL丹参素钠（0.04656 mg/L）、1 mL原儿茶醛（0.02936 mg/L）和5 mL丹酚酸B（1.762 mg/L），按供试品溶液的制备方法制备，进行测定，平均回收率，结果见表1、表2、表3。 表1丹参素钠回收率试验结果表2  原儿茶醛回收率试验结果表3  丹酚酸B回收率试验结果  取样量

    2.2.8  样品的测定   

    按供试品溶液制备方法制备样品，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，以干燥品计算含量，结果见表4。 表4  样品含量测定结果

　　3小结与讨论

    本实验采用超声处理40 min，比较了甲醇、70 %甲醇、50 %甲醇、20 %甲醇、10 %甲醇、乙醇、70 %乙醇、50 %乙醇、20 %乙醇、10 %乙醇和水等11种提取溶剂对含量的影响，结果以水作为提取溶剂，丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B总量较高；以水为提取溶剂，分别超声处理20，30，40，50 min，结果40 min提取较完全。本实验选择水作为溶剂，超声处理40 min作为实验提取条件。

    甘肃丹参、丹参中丹参素钠、原儿茶醛含量均很低，分别在0.0038 %～0.0831 %、0.0024 %～0.0171 %。丹参中丹酚酸B含量明显高于甘肃丹参，这与报道一致；华亭家种丹参所含水溶性成分与野生品相当，且丹酚酸B含量达到《药典》丹参不得低于3.0 %的限度规定，结合脂溶性成分较高、农药残留符合有关要求（另文发表），认为华亭栽培丹参符合药典规定，岷县、渭源县栽培甘肃丹参水溶性成分与野生品相当。初步认为华亭县、岷县、渭源县是适宜种植的地区，值得进一步加强种植技术研究，提高品质。

【文献】
  [1]国家药典委员会.中国药典（2005年版一部）[M].北京：化学出版社，2005:58.

[2]赵建邦.甘肃丹参的研究与应用评价[J].中药材，2003，26（7）：581.

[3]王宇红，张水寒，杨永华，等.丹参超微片水溶性有效部位的HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2007，29（4）：480.