正交实验优选丹心舒胶囊脂溶性部分的提取工艺

                   作者：李淑贤，邓小慧，梁生旺 

【摘要】  目的 优选丹心舒胶囊中脂溶性部分的最佳提取工艺。方法 分别采用高效液相色谱法和紫外分光光度法测定方中三七的3种皂苷的总含量及广枣的总黄酮的含量，以两者含量的综合评分为指标,采用正交实验考察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素对提取效果的影响。结果 丹心舒胶囊中三七、广枣等的最佳提取工艺为：以10倍药材量的70%(φ)乙醇提取2次,每次1 h。结论 该提取工艺合理、可行，为化生产提供了实验依据。

【关键词】  丹心舒胶囊;提取工艺;正交实验;皂苷;总黄酮

Optimization of extraction process for liposoluble components from Danxinshu capsules by orthogonal test

Abstract:Objective To select the optimal extraction process for liposoluble components from Danxinshu capsules. Methods L9(34) orthogonal test was conducted to evaluate the effects of ethanol concentration, ethanol consumption, extraction duration, and extraction time on the extraction by using the content of four kinds of sanchinosides and the content of the total flavonoids in axillary choerospondias fruit that were included in the recipe of Danxinshu capsules. HPLC and ultraviolet spectrophotometry were used in the assay of cumarin. Results The optimal condition for the extraction process: extract tow times with 70% ethanol, one hour per time; ethanol volume: ten times of that of the medicinal substances. Conclusion The process was rational and feasible, which could be used as the reference for mass production.

    Key words:Danxinshu capsules; extract process; orthogonal test; saponins; total flavones

　  丹心舒胶囊由三七、丹参、广枣、桃仁等中药组成。本方为活血化瘀、通窍止痛类药物,并能扩张血管、增加冠状动脉血流量，用于冠心病、心绞痛等症。三七为方中君药, 主要功能为活血化瘀、消肿止痛等。三七主要有效成分为三七皂苷类化合物［1］，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1是其中的代表性成分［2］。据报道，广枣中的总黄酮(TFC)对心血管系统具有广泛的药理作用，并可影响免疫功能［3］。因此,本文拟以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三者的总提取量及广枣中总黄酮的提取量的综合评分作为考察指标,研究筛选丹心舒胶囊中三七、广枣等药的提取工艺。现将结果报道如下。

    １  材料与试剂

    Waters2995型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters 2996 PDA检测器，Hypersil C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，迪马公司）；KQ?100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TC?15型恒温电热套（海宁市华星仪器厂）；UV?2450分光光度计（日本岛津）。

    　　人参皂苷Rg1（批号：110703?200425）、人参皂苷Rb1（批号：110704?200420）、三七皂苷R1（批号：110745?200415）、芦丁（批号：100080?200306）等对照品均购自药品生物制品检定所；甲醇（天津市四友生物医学技术有限公司，色谱纯）；乙腈（迪马，色谱纯）；屈臣氏蒸馏水。

    2  方法与结果

    2.1  正交实验设计

    以提取物中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1三者的总含量及广枣中总黄酮的提取量的综合评分为指标,考察提取时间(A)、乙醇浓度(B)、乙醇用量(C)、提取次数(D) 4个因素对提取结果的影响,每个因素按3个水平设计实验方案。见表1。表1  因素水平表

　　2.2  药材的提取

    按照L9(34)正交表安排实验,把各饮片分别粉碎成粗粉,按处方比例称取,置圆底烧瓶中,加入溶剂,用套式恒温器加热回流提取,趁热过滤提取液,回收乙醇，与处方中水提部分合并，浓缩至干。 

    2.3  三七中3种皂苷含量测定［4］

    2.3.1  色谱条件  色谱柱：Diamonsil C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈?水二元梯度洗脱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱程序：0→120 min流动相A(％)19→36，流动相B(％)81→64；流速： 1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm。

    2.3.2  对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷减压干燥的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1对照品适量，分别加甲醇制成人参皂苷Rg1浓度为0.459 mg/mL、人参皂苷Rb1浓度为0.371 mg/mL、三七皂苷R1浓度为0.108 mg/mL的溶液，将3者混合作为对照品溶液。

    2.3.3  供试品溶液的制备  取以上浓缩至干样品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声30 min，充分溶解后，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液，即得。

    2.3.4  测定方法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下条件进行测定。

    2.4   广枣中总黄酮的含量测定［5］

    2.4.1  对照品溶液的制备  称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品约25 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取10 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

    2.4.2  供试品溶液的制备  取以上浓缩至干样品适量，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，浸泡约1 h，振摇，使充分溶解，滤过，置50 mL 量瓶中，用甲醇少量多次洗涤锥形瓶及滤纸，洗液并入滤液，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

    2.4.3  标准曲线的绘制  精密量取芦丁对照品液各0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置25 mL量瓶中。加水至6 mL, 加5%亚硝酸钠液1. 0 mL,放置6 min。加10%硝酸铝试液1. 0 mL,放置6 min,加4%氢氧化钠试液10 mL,加水至刻度,摇匀。放置15 min后,以相应试剂作空白,于510 nm进行测定。以吸收度作纵坐标，溶液质量浓度作横坐标，结果得回归方程：Y=0．0379+0．0281X，r=0．999 3，线性范围：0．24～1．2 mg。

    2.4.4  加样回收率试验  精密称取同一份已知含量的供试品溶液6份,分别精密加入芦丁对照品,按“2.4.2”项方法制备溶液,按“2.4.3”项方法测定并回收率,结果平均回收率为98．9%，RSD为0.95%。

    2.4.5  测定方法   分别精密吸取芦丁对照品溶液3 mL和供试品溶液2 mL，按“2.4.3”项方法进行测定。

    2.5  正交试验结果

    根据两个指标意义的不同，以有效成分的含量作为主要影响指标，确定其权重系数分别为0.6、0.4，按下式计算综合分：综合分=(三七总皂苷含量/三七总皂苷含量的最大值)×0.6+(广枣总黄酮含量/广枣总黄酮含量的最大值)×0.4。

    正交试验结果及分析见表2，3。由表2可知,各因素对提取物中三七皂苷含量的影响大小次序为: C>A>B>D,C因素对提取结果有显著性影响。表3结果表明，乙醇用量、乙醇浓度对结果都有显著影响，提取时间、提取次数对结果影响不大。从方差分析结果及节约生产成本的角度考虑，最终确定最佳提取条件为A2B2C2D2，即加10倍量体积分数70%乙醇回流提取2次，每次1 h。

    2.6  最佳提取工艺的验证

    按照最佳提取工艺重复提取3次,按以上方法测定提取物中3种三七皂苷的总含量及广枣中总黄酮的含量,结果分别为6.662 3 mg和17.236 95 mg,证明所确定的提取工艺为最佳提取工艺。 表2  正交试验结果表3  方差分析结果

    3  讨 论

    3.1  处方中有多味药材时，其制剂工艺的评价如采用单一指标则代表性较差，用不同种类的成分作为评判指标的结果才有较广泛的代表性。由于不同药材中的成分含量有时不在同一数量级，直接累加则使含量大的成分对结果的贡献大，而含量小的贡献小，不符合组方原则及治则。通过权重系数法可使不同数量级的数据整齐可比，可直接进行累计评价。本文采用多指标评价方法，最终优选出丹心舒胶囊的最佳提取工艺参数。

    3.2  在提取效果考察指标的确定方面,笔者采用三七中3个指标成分的含量,而且以广枣有效部位所含黄酮类化合物总含量作为考察指标,原因在于二者所含皂苷类和黄酮类成分均为该方的主要有效成分,用君药的有效成分作为考察指标,虽然能够准确地反映该药味成分的提取效果,却不能反映其他有效成分的真实提取情况。故以三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的总提取量及广枣中总黄酮的提取量作为提取工艺的考察指标,更能反映该方有效成分的提取情况。

【】
  ［1］ 胡志洁，张志耘.三七总皂苷对心脑血管的药理作用研究［J］.天津药学，2006，18（6）：51.

［2］ 王 雁.不同商品规格三七中3种皂苷的高效液相色谱法含量测定［J］.中药材，2005，28（1）：33.

［3］ 顾维彰,顾铠. 蒙药广枣及其总黄酮的研究进展［J］.包头医学院学报，2004，20（3）：258-259.

［4］ 赵玉梅, 李淑贤, 梁生旺,等.丹心舒胶囊中三七和丹参的有效成分含量测定［J］ .广东药学院学报，2007，23（6）：644-645.

［5］ 花仲卉，安雪梅，王伟内.比色法测定广枣醇提物中总黄酮的含量［J］.海峡药学,2003,15(6)：36-37.