叶酸偶联5?氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备及其体外性质研究

【摘要】  目的 研究叶酸偶联壳聚糖载5?氟尿嘧啶纳米粒的制备方法及体外性质。方法 根据叶酸与壳聚糖的偶联比选择最佳工艺条件,通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应,制备叶酸偶联壳聚糖,再通过离子交联法制备叶酸偶联壳聚糖纳米粒包合5?氟尿嘧啶,从而制成载药纳米粒。结果 制备了叶酸壳聚糖偶联物,并包合5?氟尿嘧啶成纳米粒,载药量为10.4%，包封率为50.5%，8 h累积释药量达35.9%。结论 优化了叶酸偶联5?氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备工艺。

【关键词】  叶酸;纳米粒;5?氟尿嘧啶;壳聚糖

    Abstract:Objective To prepare folate?conjugated 5?fluorouracil?chitosan nanoparticles (5?FU?CSNP?folate) and evaluate its property in vitro. Methods The optimal technological conditions were selected according to the conjugated ratio of folate and chitosan. Folate?conjugated chitosan was prepared by the reaction of the activated folate ester with the amine group of chitosan. Folate?conjugated 5?fluorouracil?chitosan nanoparticles were then prepared with ionic cross?linking. Results Folate?conjugated 5?fluorouracil?loaded chitosan was prepared through different ways, and nanoparticles loading 5?FU was prepared. The encapsulation ratio of 5?FU?CSNP?folate was 50.5% and the drug loading was 10.4%. The total amount of accumulated release was 35.9% at the eighth hour. Conclusions The preparation condition of 5?FU?CSNP?folate was optimized.

    Key words:folate; nanoparticles; 5?fluorouracil; chitosan

   5?氟尿嘧啶(5?fluorouracil，5?FU)属抗代谢类抗癌药,对消化道恶性肿瘤及其他实体瘤具有良好的效果,但单独使用常产生胃肠道毒性及骨髓抑制等毒副作用,且对肝、肾功能均有损害。近年来，通过化学修饰或将5?FU包裹在不同载体材料中制成纳米球，以形成一种新型的药物控释体系来降低5?FU毒副作用的研究已成为研究热点。叶酸（Folate，F）受体靶向就是一种近来备受青睐的新型抗肿瘤机制，它是利用叶酸受体在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性而实现叶酸偶联药物的靶向输送。而偶联载体以大分子物质为主有利于延长体内保留时间，提高疗效。壳聚糖是一种价廉易得、便于修饰、无毒、生物相容性好,并兼有一定抗肿瘤活性的生物大分子,广泛用于药物治疗载体。此外,近来被广泛应用到制药工艺中的纳米技术可进一步提高药物的稳定性，并实现缓释和控释给药。本课题选择壳聚糖(chitosan，CS)为抗肿瘤药物给药系统的载体材料，通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应,制得叶酸偶联的壳聚糖，并以5?FU为抗肿瘤模型药物,通过离子交联法制得叶酸偶联的载5?FU壳聚糖纳米粒。

    1  材料与仪器

    1.1  材料

    壳聚糖 (CS,山东奥康有限公司,脱乙酰度为95.8%)，多聚磷酸钠(TPP,天津市福晨化学试剂)，SephadexG?25葡聚糖凝胶(pharmacia)，5?氟尿嘧啶（5?FU，南通精华制药有限公司）,叶酸(上海新量化工试剂有限公司), 无水二甲基亚砜(DMSO)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N?羟基琥珀酰亚胺(NHS)等试剂均为国产分析纯 。

    1.2  仪器

    SHZ?82恒温震荡器（金坛市富华仪器有限公司），TU1700紫外可见分光光度计（苏州岛津仪器有限公司），H?600透射电镜（HITACHI），1000HSA激光粒度分布仪（英国马尔文公司）。

    2  叶酸偶联壳聚糖(F?CS)的制备和纯化

    2.1  叶酸活性酯的制备

    称取叶酸300 mg(0.67 mmoL),溶于无水DMSO 10 mL中,再加入DCC 93 mg(0.45  mmoL)和NHS 77 mg(0.67 mmoL)及三乙胺500 μL,反应过夜,过滤除去反应副产物二环己基脲（DCU）,减压蒸馏除去部分溶剂,在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30%丙酮的无水乙醚溶液中,得到黄色沉淀物,过滤,真空干燥,得到叶酸活性酯［1］。

    2.2  叶酸偶联壳聚糖的制备

    　　称取20 mg壳聚糖（分子质量5 kD）,悬浮于5 mL无水DMSO中,磁力搅拌下逐滴滴入叶酸活性酯DMSO溶液2 mL,在适当温度（50 ℃）下反应2 h,过滤，滤渣用蒸馏水洗涤数次，用质量分数2%醋酸溶液10 mL溶解,低速离心后取其上清液,用SephadexG?25葡聚糖凝胶柱进行分离,收集，冷冻干燥后备用。

    2.3  叶酸偶联壳聚糖的纯化

    2．3．1  叶酸偶联壳聚糖的纯化  选用SephadexG?25葡聚糖凝胶柱进行分离,以质量分数2%的醋酸溶液为流动相进行洗脱,流速为1.5 mL/min，在叶酸波长为363 nm处监测洗脱过程，叶酸偶联壳聚糖的洗脱曲线见图1。 由图1可见,第一个峰对应的是分子量大的叶酸偶联壳聚糖,第二个峰对应的是分子量较小的游离叶酸,表明2者通过凝胶柱的分子筛效应得到了完全的分离。

    2.3.2  叶酸偶联壳聚糖的紫外扫描  图2为纯化后的叶酸偶联壳聚糖及壳聚糖在醋酸水溶液的紫外扫描比较图。由图可见壳聚糖在240～500 nm范围内无紫外吸收,而纯化后的叶酸偶联壳聚糖在280 nm处显示了叶酸的特征吸收峰。结果表明叶酸已成功与壳聚糖偶联。广东药学院学报，2008，24(6)第6期  何练芹,等.叶酸偶联5?氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备及其体外性质研究

    2.3.3   叶酸偶联壳聚糖制备工艺优化

    2.3.3.1  叶酸标准曲线的制备  精密称取叶酸11.5 mg,置100 mL容量瓶中,用醋酸?醋酸钠缓冲液(pH=5.8)溶解并稀释至刻度,分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中,用醋酸?醋酸钠缓冲液稀释至刻度,以醋酸?醋酸钠缓冲液为空白,用紫外分光光度计在363 nm 处测定吸光度,以叶酸质量浓度对吸光度作标准曲线,得回归方程A=0.0142ρ+0.0034(r=0.999 8)，表明叶酸的质量浓度在5.75～34.5 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

    2．3．3．2  偶联比的  精密称取少许纯化后叶酸偶联壳聚糖的冻干粉,溶解于2%醋酸中,用2%醋酸定容至10 mL,然后在363 nm处测定紫外吸光度,计算每毫克叶酸偶联壳聚糖中叶酸的含量。

    偶联比=被偶联的叶酸的量（mg）被偶联的壳聚糖的量（mg）=M叶酸×N叶酸M壳聚糖×N壳聚糖

    2．3．3．3  正交试验  采用L9（34）正交试验表，以偶联比为指标，考察叶酸?壳聚糖的质量比、反应时间、反应温度3个因素。因素水平表及试验结果见表1-表3。  表1  因素水平表表2  L9（34）正交设计表表3  方差分析表
 从上表可知,各因素对偶联比的影响程度为A>B>C,反应的最佳工艺条件为A3B3C1,即叶酸与壳聚糖用量比为2∶1,反应温度50 ℃,反应时间2 h。

    　　按最佳工艺制备叶酸偶联物,所得的叶酸偶联壳聚糖的偶联比为0.160，即每个壳聚糖分子上大约偶联18个叶酸分子。根据报道［3］,在叶酸壳聚糖偶联物上平均一个壳聚糖分子上偶联3个叶酸分子已有较强的靶向性,所以笔者认为已达到实验目的。

    3  载5?FU的叶酸偶联壳聚糖纳米粒制备

    将适量的5?FU溶于NaOH溶液，往高速搅拌的叶酸偶联的壳聚糖醋酸溶液中逐滴滴加，调节pH至5.0，然后往搅拌的溶液中滴加一定浓度的TPP溶液，搅拌10 min，即得载药纳米粒。取一定量的5?FU叶酸偶联壳聚糖纳米粒于吐温水溶液中超声分散后，在透射电镜下拍照（图3、图4）。结果表明所得纳米粒形态圆整，大小均一，粒径在200 nm以内，表面较光滑，基本为类球形的实体粒子，空白纳米粒粘连不严重，载药后粘连较严重。粒径分布情况见图5。

    4  载药量、包封率和累计释放度的测定

    4.1  5?FU标准曲线的制备

    精密称取5?FU 20 mg，用0.1 mol/L盐酸溶液溶解并配成系列浓度，于265 nm波长处测定吸光度，以质量浓度（ρ）对吸光度（A）作线性回归得标准曲线。标准曲线方程为：A=0.0527ρ+0.0206(r=0.999 9),表明5?FU的质量浓度在20～120 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

    4.2  载药量和包封率的测定

    将制备的载药纳米粒动态透析72 h,期间换透析介质水3次，除去黏附未包裹的5?FU,透析后冷冻干燥。精密称取纯化后叶酸偶联壳聚糖载药纳米球约50 mg,置于100 mL烧瓶中,加0.1 mol/L盐酸溶液50 mL,60 ℃水浴回流3 h使纳米球完全溶解,放冷,定容,过滤,取滤液1 mL稀释至10 mL,于265 nm处测定吸光度。按标准曲线游离5?FU的量，并计算包封率和载药量。结果测得包封率为50.5%，载药量为10.4%。

    4.3  载药纳米粒体外释放的测定

    　精密称取冻干后的载药纳米粒60.0  mg，置预先处理好的透析袋中，加入5．0 mL磷酸缓冲液(PBS,pH7.4),扎紧透析袋两端,悬浮于100.0 mL具塞锥形瓶中,锥形瓶中加入45.0 mL的磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)，将其置水浴振荡器中（温度37 ℃，振荡频率为100次/min）。于不同时间点取透析袋外PBS 5.0  mL，在265 nm处测定吸光度,同时补入5.0 mL等量的新鲜释放介质。根据标准曲线方程，计算其浓度和累积释放量，取3次实验的平均值,以累积释药百分率对时间作图,绘制载药纳米粒的释放曲线。5?FU在各时间点的累积释放百分率(Q)计算公式为：Q(％)=(V0×Ct+V× ∑t-1n=1C)×100％ ·m-1·X-1，式中Ct为各时间点测得释放介质中的5?FU浓度(mg·mL-1),m-1为投入的5?FU纳米粒的质量),V0为释放介质的总体积,V为每次取样体积,X-1为测得5?FU纳米粒的载药量(％)。

    5  讨 论

    5．1  针对壳聚糖水溶性差的特性，采用了先偶联叶酸，后制备纳米粒的方法，首次成功制备了叶酸偶联壳聚糖载药纳米粒，并进行了优化工艺的研究。壳聚糖易溶于稀酸溶液中,但在酸性条件下发生降解,所以选用弱酸型刺激性小的醋酸。利用无毒副作用的三聚磷酸钠（TPP）对叶酸偶联壳聚糖进行离子诱导凝胶化，可在一定条件下方便地制备出基于叶酸偶联壳聚糖的纳米给药载体。在室温、搅拌情况下，通过带负电的磷酸根离子与壳聚糖分子链上带正电的质子化氨基发生分子内和分子间交联凝胶化，便可迅速生成纳米粒子。为了获得高产率、稳定且坚固的纳米结构微粒，叶酸偶联壳聚糖与TPP的质量比一般控制在3∶1到6∶1之间。本文选择叶酸偶联壳聚糖与TPP的质量比为6，体积比为3，短时间搅拌后即生成具白色乳光的纳米粒混悬液。由于壳聚糖的醋酸水溶液,特别是高浓度的醋酸水溶液比较黏稠,而且H+ 与2位?NH2 结合酸度下降,5?FU不易溶解,成粉状混在其中，所以先用NaOH溶液溶解5?FU，从一定程度上解决载药后粘连较严重的问题。

    5．2  从叶酸偶联5?FU壳聚糖纳米粒的释药曲线可看出：第一个阶段为突释,时间为8 h内，其原因可能是纳米球表面结合的药物分子,由于和介质存在着强相互作用,容易从表面脱落释放,也在纳米球表面留下小孔，为药物进一步释放提供了通道；第二个阶段为扩散,8～24 h内,其原因是由于聚合物溶蚀，导致融溶在聚合物网状结构中的药物从水溶性孔道以扩散方式释放；第三个阶段为降解,24 h后,其原因是药物因聚合物降解而释放,降解产物是链短、相对分子量小且能溶于水的化合物,致使纳米球水溶性孔道增多,纳米球疏松,药物释放速度加快，在该阶段药物释放受降解和扩散共同控制。

【文献】
  ［1］ GUO W J, GEORGE H, HINKLE W, et al.99mTc?HYNIC?Folate:a novel receptor?based targeted radiopharmaceutical for tumor imaging［J］.J Nucl Med,1999,40(9):1563-1569.

［2］ 张良珂,候世祥,毛声俊.叶酸偶联白蛋白纳米粒制备工艺研究［J］.生物医学工程学杂志,2004,21(2):225-228.

［3］ LU Y J，LOW P S．Folate?mediated delivery of macromo?lecular anticancer therapeutic agents［J］．Adv Drug Del Rev,2002,54(5)：675-693．