肾康丸对糖尿病肾病大鼠肾脏TGF?β1/Smad 7通路的影响

【摘要】  目的 探讨肾康丸对糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏TGF?β1/Smad 7信号通路的影响。方法 用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射法诱导建立大鼠糖尿病（DM）模型，模型成功后随机分为3组：模型对照组、开搏通组、肾康丸组，另设正常对照组。8周后，取大鼠肾脏，采用免疫组化法观察各组大鼠肾脏组织纤连蛋白（FN）、转化生长因子?β1（TGF?β1）和Smad 7蛋白表达的情况。结果 8周后，DN模型组大鼠与正常大鼠比较，肾脏组织中FN和TGF?β1蛋白表达明显增加，Smad 7蛋白表达明显减少。肾康丸和开搏通都可以减少FN和TGF?β1蛋白的表达，增加Smad 7蛋白的表达。结论 肾康丸可以抑制DN大鼠肾脏中TGF?β1/Smad信号传导通路的激活，减少ECM的沉积，从而延缓DN进程。

【关键词】  肾康丸；糖尿病肾病；TGF?β1/Smad信号通路
　　Abstract:Objective To explore the effects of the Shenkangwan pills on the TGF?β1/Smad 7 signaling pathway in the kidneys of the DN rats. Methods  The diabetic rat models were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）and randomly divided into 3 groups：model control group；Capoten group and Shenkangwan group. Some other rats were used as normal control group. All rats were administered with corresponding drugs for 8 weeks. After the last administration，the kidneys of the rats were taken out. The protein expression of FN, TGF?β1 and Smad 7 were detected with the method of immune histochemistry. Results  The renal tissue protein expressions of FN and TGF?β1 in the rats of DN model group were increased than those in the rats of normal group. While the protein expression of Smad 7 was decreased distinctly in these rats’ kidneys. Compared with those in the rats of the DN model group，the protein expressions of FN and TGF?β1 in the rats of Shenkangwan and capoten group were decreased markedly. While the protein expression of Smad 7 was increased distinctly in these rats’ kidneys. Conclusion  Shenkangwan could restrain the activation of TGF?β1/Smad signaling pathway in the renal tissue of DN rats and reduced the synthesis and secretion of the ECM，which would  stay the course of the DN.

　　Key words:Shenkangwan pills；diabetic nephropathy；TGF?β1/Smad signaling pathway

　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者临床常见而难治的微血管并发症，是导致终末期肾病（ESRD）和DM患者死亡的主要原因［1］。如何有效预防DN发生,具有重要意义。肾康丸在临床治疗DN患者多年，疗效确切。临床观察和动物实验研究都表明，该药在一定程度上可改善DN一般症状，保护肾脏，延缓DN的进展［2，3］。本研究通过动物实验，从TGF?β1/Smad信号通路出发，进一步探讨肾康丸治疗DN的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物
    　　
　　SPF级Wistar雄性大鼠，体质量190～230 g ，购于南方医科大学动物实验中心，合格证号：粤检证字第2004A031号。

　　1.2  受试药品和主要试剂
    　　
　　肾康丸，南方医科大学珠江药剂科生产，批号：20031214；开搏通片，上海中美施贵宝药业有限公司生产，批号：0402032；链脲佐菌素（STZ），Sigma公司；FN、TGF?β1、Smad 7兔抗大鼠多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司（Boster）；即用型SABC（链霉亲和素?生物素?过氧化物酶复合物）免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒，Boster公司。

　　1.3  主要仪器
      
　　One touch ultra 血糖仪及其配套试纸，美国强生公司； RM2135型超薄组织切片机、DM?IRB型倒置显微镜、MPS30型照相机，LEICA公司。

　　1.4  方法
    　　
　　按65 mg·kg-1腹腔内一次性注射链脲佐菌素（STZ）制作DM大鼠模型。STZ用枸橼酸钠缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 4.5）配制。另设正常对照组（n＝8只）。连续喂养2周，测血糖、尿糖、尿量，若血糖值高于16.7 mmol·L-1、尿糖（+++）以上、尿量增加1倍以上，则造模成功。造模成功后，随机分为3组：模型对照组、开搏通组和肾康丸组。开搏通、肾康丸组分别按5 mg·kg-1、1.2 g·kg-1（按照人与大鼠体表面积换算，分别相当于70 kg成人37.5  mg·d-1、12 g·d-1）质量灌服相应药物，连续8 周。对照组灌服等容积生理盐水。末次给药后12 h，麻醉，取左肾，10% (φ)甲醛中性缓冲液中固定，待做免疫组化检测。

　　1.5  观察指标和测定方法

　　1.5.1  免疫组化法检测肾脏组织FN 蛋白的表达 

　　采用SABC免疫组化检测方法。肾组织10%(φ)甲醛中性缓冲液中固定24 h；将固定好的标本置于梯度酒精和二甲苯浸泡；50～60 ℃浸蜡1～2 h，冷却，修块，切片，按实验分组编号，烤片（80 ℃，2 h）；常规脱蜡；滴加复合消化液进行抗原修复；滴加5％BSA封闭液，室温，20 min；依次滴加FN一抗、二抗后，与SABC结合；DAB显色；脱水，透明，中性树胶封片；在显微镜下观察、拍照。阴性对照以 PBS 代替一抗，其余步骤同上述各步。

　　1.5.2  免疫组化法检测肾脏组织TGF?β1、Smad 7蛋白的表达

　　方法同FN蛋白的测定，只是抗原修复用0.01 mol·L-1枸橼酸?枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）进行，一抗分别为兔抗大鼠TGF?β1多克隆抗体和兔抗大鼠Smad 7多克隆抗体。

　　2  结 果

　　2.1  大鼠肾脏组织FN蛋白表达情况
    　　
　　正常组大鼠肾脏FN在肾小球基底膜、系膜基质区有微弱表达，着色较浅。模型组在肾小球基底膜、系膜基质区有极强阳性表达，着色极深，说明FN蛋白表达增强。各组FN在上述部位有弱阳性表达，着色较浅，说明经肾康丸和开搏通治疗后可以减少DN大鼠FN蛋白的表达。见图1。

　　2.2  大鼠肾脏组织TGF?β1蛋白表达情况

    正常组大鼠肾脏在肾小球和肾小管上皮细胞中均有TGF?β1蛋白表达，但量较少，着色较浅。模型组大鼠在上述部位的TGF?β1蛋白表达量增加，呈极强阳性表达，着色较深。各治疗组TGF?β1在上述部位也有弱阳性表达，介于正常大鼠和模型大鼠之间，说明经肾康丸和开搏通治疗后可以减少DN大鼠TGF?β1蛋白的表达。

　　2.3  大鼠肾脏组织Smad 7蛋白表达情况
    　　
　　正常大鼠肾脏可见Smad 7蛋白表达的阳性颗粒，主要见于肾小球和肾小管，着色较深，表达量较多。与正常大鼠相比，模型组在上述部位的Smad 7蛋白的阳性颗粒明显减少，说明DN大鼠肾脏组织中Smad 7蛋白表达减少。各治疗组Smad 7蛋白的表达有所增强，说明肾康丸和开搏通可以增加Smad 7蛋白的表达。

　　3  讨 论
    　　
　　转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF?β1）在DN发病中的作用不容忽视，TGF?β1通过自分泌与旁分泌途径，诱导肾小球及肾小管细胞肥大，促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积聚，是DN发病过程中的重要因子［4］。无论是在STZ诱发的DM大鼠的肾脏，还是在自发性DM大鼠（BB）以及自发性DM小鼠（NOD）的肾脏，TGF?β1 mRNA的表达和其蛋白质含量均明显升高，同时伴肾脏肥大和ECM增多［5］。
    　　
　　Smads家族蛋白是新近发现的参与TGF?β超家族在细胞内信号传导的一族蛋白质。迄今为止，在哺乳动物中已经分离鉴定的Smad蛋白有9种［6］，用Smad 1?9表示，按功能可分成3类：受体活化Smad（R?Smads）、共配偶体Smad（Co?Smad）和抑制性Smad（I?Smads）。活化的TGF?β1受体磷酸化激活受体活化型 Smads（Smad 2，3）蛋白，吸引共配偶体型Smad 4形成低聚体复合物，转移到细胞核内，调节转录活动，同时可以激活核内ECM成分如各型胶原、纤维黏连蛋白等启动子的活性，从而增加ECM合成。同时这一复合物可以引起抑制性的Smad 7 蛋白启动子转录增加，表达上调，Smad 7可竞争性地与TGF?β1受体结合，反馈性抑制 Smad 2，3 磷酸化，起到调节作用。
    　　
　　FN是ECM中主要的成分。在肾小球疾病的发生及过程中，FN的含量往往升高，并且这一变化出现早而明显，被认为是加速肾纤维化及硬化的重要因素。FN能联合形成一种难溶的二硫化物交连基质并支配二硫化物异构酶（PDI）活性。使用FN PDI抑制剂能明显减少这种联合成难溶的二硫化物基质，减少DN肾脏组织ECM的过度沉积［7］。
    　　
　　本实验中，DN大鼠肾脏组织TGF?β1 蛋白表达水平均较正常组大鼠明显升高，受体抑制性蛋白Smad 7的蛋白表达明显减少，FN 蛋白的表达明显增加，说明DN大鼠肾脏中TGF?β1/Smad信号通路处于激活状态，从而使FN合成增加，导致ECM进行性积聚。肾康丸治疗后，可以抑制DN大鼠肾脏组织中TGF?β1 蛋白的表达，增加Smad 7蛋白的表达，从而抑制TGF?β1/Smad信号通路的激活，减少FN 蛋白的表达，减轻ECM的积聚，从而延缓肾小球硬化和DN进程。

【】
  　　［1］LEA J P，NICHOLAS S B. Diabetes mellitus and hypertension：key risk factors for kidney disease［J］. J Natl Med Assoc，2002，94（8）：7-15.

　　［2］陈国宝，魏连波，龙海波.肾康丸治疗早期糖尿病肾病的临床研究［J］.浙江中医杂志，2006，41（5）：260-261.

　　［3］肖炜，魏连波，马云，等.肾康丸对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究［J］. 中药杂志，2006，32（12）：1007-1009.

　　［4］BOTTINGER E P, BITZER M. TGF?beta signaling in renal disease［J］. J Am Soc Nephrol，2002，13（10）：2600-2610.

　　［5］肖炜，马云，魏连波. TGF?β/Smads 信号通路与糖尿病肾病［J］. 国外医学：泌尿系统分册，2005，25（5）：676-679.

　　［6］SCHNAPER H W，HAYASHIDA T，PONCELET A C. It’s a Smad World：Regulation of TGF-β signaling in the kidney［J］. J Am Soc Nephrol，2002，13（4）：1126-1128.

　　［7］WESTON B S，WAHAB N A，ROBERTS T，et al. Bacitracin inhibits fibronectin matrix assembly by mesangial cells in high glucose［J］. Kidney Int，2001，60（5）：1756-1764.