反相离子对高效液相色谱法测定祖卡木颗粒中吗啡的含量
作者：张庆雷，李雪君，刘峰，周宏兵
【摘要】 目的 建立祖卡木颗粒中吗啡的含量测定方法。方法 以Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱，流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钾、0.01 mol/L庚烷磺酸钠混合溶液?乙腈?三乙胺（体积比85∶15∶0.03），体积分数为5%的冰醋酸调pH值为4.9；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。结果 吗啡的线性范围为5.22～52.2 μg/mL，r=0.9999,平均回收率为96.74％，RSD=0.95％。结论 本文建立的方法简便，测定结果准确，重复性好，可用于该制剂中吗啡的含量测定。
【关键词】 祖卡木颗粒；吗啡；反相离子对色谱
Abstract:Objective To set up an ion?pair RP?HPLC method for determining the content of morphine in Zukamu granules.Methods The analysis was performed on an Hypersil BDS C18 column (4.6 mm×250 mm,5 μm). The mobile phase was a mixture of 0.01 mol/L potassium dihydrogen phosphate and 0.01 mol/L sodium heptanesulfonate?acetonitrile?triethylamine（85∶15∶0.03），adjusted with 5% glacial acetic acid to pH 4.9. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength 240 nm. Results The linear range of morphine was 5.22～52.2 μg/mL（r=0.9999）. The average recovery was 96.74％ with RSD 0.95％. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible and can be used for the determination of morphine content in Zukamu granules.
Key words:Zukamu granule；morphine；ion?pair RP?HPLC
罂粟壳为罂粟科植物罂粟Papaver somniferum L.的干燥成熟果壳，其主要成分为吗啡(morphine)、可待因(codeine)、蒂巴因(thebaine)、那可汀(narcotine)、罂粟壳碱(narcotoline)和罂粟碱(papaverine)；另含多糖约2.4%，水解可得乳糖等多种成分。
祖卡木颗粒由山柰、睡莲花及罂粟壳等多味中药制成，罂粟壳中吗啡成分的含量较高，吗啡具有镇痛、止咳、止喘等功效，为本方有效成分之一，但人体摄入吗啡过量，可使人产生依赖性及神经精神疾病，因此需要控制其含量。为了提高制剂的质量控制水平，本文药典［1］和［2］，在祖卡木颗粒质量标准研究中，研究制定了高效液相色谱法测定吗啡的含量，以控制药品的质量。
1 仪器与试药
LC?10AT高效液相色谱仪（岛津），HW?2000色谱工作站，BDS C18柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）（大连依利特），超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。乙腈（色谱纯，美国Tedia），水为超纯水，其他试剂均为分析纯，吗啡对照品（中国药品生物制品检定所，批号：171201－200420），祖卡木颗粒（新疆奇康哈博维药有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钾、0.01 mol/L庚烷磺酸钠混合溶液?乙腈?三乙胺（体积比85∶15∶0.03），体积分数为5%的冰醋酸调pH=4.9；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。理论塔板数按吗啡峰不低于3 000。
2.2 对照品溶液的制备
取吗啡对照品适量，105 ℃下干燥1 h，精密称定，置棕色量瓶中，加流动相制成每1 mL含52.2 μg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取装量差异项下的内容物，研细，精密称定约2.5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加氨试液10 mL，待样品粉末充分润湿后，加三氯甲烷50 mL，振摇5 min，超声提取70 min；移置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤锥形瓶，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，碱液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，置水浴中挥去三氯甲烷；残渣用少量流动相溶解（可加热），移至10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，静置，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.4 阴性样品溶液的制备
取不含罂粟壳的阴性样品，按“2.3”项下方法制成阴性样品溶液。
2.5 干扰试验
分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，三者的色谱图表明阴性样品溶液在吗啡保留处无吸收峰，处方中其他组分对吗啡的含量测定无干扰，见图1。
A.对照品 B.样品 C.阴性样品（缺罂粟壳）
图1 祖卡木颗粒的HPLC谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms of Zukamu granules
2.6 线性关系
分别精密吸取吗啡对照品溶液1、2、3、4、5、6、8、10 mL置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别取20 μL进样，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值（A）为纵坐标，对照品质量浓度(ρ)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=8 748.1ρ+1 342.2（r=0.9999），结果表明吗啡质量浓度在5.22～52.2 μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.7 精密度试验
取吗啡对照品溶液连续进样5次，每次20 μL，按上述色谱条件测定峰面积，结果峰面积分别为457 597、455 700、458 374、459 938、460 905，RSD为0.29％，结果表明精密度良好。
2.8 稳定性试验
取同一批供试品溶液（批号：060416），分别于0、2、4、6、8 h进样，进样量均为20 μL，按上述色谱条件测定峰面积，测得供试品中吗啡峰面积值分别为340 860、335 796、337 715、329 813、334 931，RSD为1.21％。结果表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.9 重复性试验
取同一批号（批号为060416）的祖卡木颗粒，按“2.3”项下方法分别制备5份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，吗啡平均含量为0.153 4 mg/g，其RSD=1.50%。结果表明方法重复性良好。
2.10 回收率试验
取已知含量的样品(批号060225?2，91.97 μg/g)6份，每份约1.25 g，精密称定，置100 mL具塞三角瓶中，分别精密加入吗啡对照品溶液(116.2 μg/mL)1 m L，按“2.3”项下供试品溶液制备方法，自“加氨试液10 mL……”起，制备加样供试品溶液。按上述色谱条件测定吗啡含量，测得平均加样回收率为96.74％，RSD=0.95％。结果见表1。
表1 吗啡回收率试验结果（略）
Tab.1 Results of recovery test(n=6)
2.11 样品含量测定
取4批祖卡木颗粒样品按“2.3”项下方法处理，取处理好的制剂样品溶液，进样20 μL，计算每批样品的含量，结果见表2。
表2 样品测定结果（略）
Tab.2 Morphine content of the sample
3 讨论
3.1 提取方法的选择
考察了固相萃取法和溶剂萃取法，固相萃取法由于各固相柱间差异，操作上重现性不好，导致测量结果不稳定，并且固相柱成本较高，后改为溶剂萃取法。先后比较了用醋酸乙酯、甲苯、乙醚、三氯甲烷等作为萃取的有机相，结果以三氯甲烷效果最好。碱化试剂考察了氨水和氨试液，结果发现用氨水碱化提取效果很不好，而用氨试液效果较好。按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别考察了冷浸法（室温24 h）和超声法，结果表明超声提取法提取效率高。超声法考察了超声时间，分别超声50、60、70、80、90、100 min提取；结果以超声70 min最好。
3.2 色谱条件的选择
按“2.2”项下方法制备吗啡对照品溶液，在紫外分光光度计上进行扫描测定，同时参照药典［1］及有关［3］，选择240 nm为检测波长。
流动相考察了药典方法［1］、醋酸铵?三乙胺?甲醇体系［4］，KH2PO4?CH3CN?NaSO3C7H15体系等。通过试验比较最后确定以KH2PO4?CH3CN?NaSO3C7H15体系最好，因为在流动相中加入庚烷磺酸钠作为反离子试剂，可以与吗啡形成离子对化合物［5］，有利于其在固定相上的保留和分离。又进一步考察了流动相各组分比例、三乙胺加入量和流动相的pH值。最终确定“2.1”项下色谱条件。
【文献】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学出版社，2005：256-257.
［2］ 杨秀伟.生物碱［M］.北京：化学工业出版社，2005：213-218.
［3］ 王刚，常寿元.HPLC测定力神止咳糖浆中吗啡的含量［J］.中成药，2001，23(4)：289-290.
［4］ 郝红艳，郭济贤，顺庆生，等.HPLC和HPCE法测定罂粟壳中3种生物活性生物碱［J］.药学学报，2000，35(4)：289-293.
［5］ 刘文英.药物分析［M］.5版.北京：人民卫生出版社，2004：312-313.
