RP?HPLC法测定复方青骨凝胶中大黄素的含量
【摘要】 目的 建立测定复方青骨凝胶中大黄素含量的方法。方法 采用RP?HPLC法，以Waters Xterra RP18(3.9 mm×150 mm,5.0 μm)为色谱柱；甲醇?水?磷酸（体积比80∶20∶0.1）为流动相；检测波长：440 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。结果 大黄素的进样量在0.352 4～1.762 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r＝0.999 9；平均加样回收率为101.99％，RSD为2.79% (n=6)。结论 本方法简便、快速、准确，可作为复方青骨凝胶中大黄素的含量测定方法。
【关键词】 复方青骨凝胶；高效液相色谱法；大黄素
Abstract:Objective To establish a RP?HPLC method for determining the content of emodin in Fufang Qinggu gel. Method The sample was analyzed on a Waters Xterra RP18 (3.9 mm×150 mm, 5.0 μm) column by using methanol?water?H3PO4（80∶20∶0.1）as mobile phase. The detection wavelength was at 440 nm and flow rate 1.0 mL·min-1.Result The linear range of sinomenine was 0.352 4～1.762 0 μg (r＝0.999 9). The average recovery was 101.99％with RSD 2.79% (n=6).Conclusion This method is simple，rapid and accurate which could be used for determining the content of emodin in Fufang Qinggu gel.
Key words:Fufang Qinggu gel； RP?HPLC ；emodin
复方青骨凝胶是在全国十佳女中医师、我院中医科杨嘉珍主任医师多年有效腰腿痛的中药汤剂验方的基础上，以青风藤、大黄、四方木皮、杜仲、骨碎补等19味中药配伍，并以卡波姆为辅料制成的、具有缓释作用的新型的复方中药外用凝胶剂，该制剂对风湿、类风湿引起的关节痛疗效确切。方中大黄为该制剂抗炎的主药之一，而大黄素为其主要成分。为了更好地控制该制剂的质量，我们［1-6］，采用高效液相色谱法测定其中大黄素的含量，结果表明方法简便、快速、准确，可作为复方青骨凝胶质量控制的方法。
1 仪器与试药
Waters液相色谱仪（Waters600泵，7725i六通阀，996二极管阵列检测器，Millennium32数据处理系统），TU?1901紫外可见分光光度计（苏州市莱顿仪器有限公司）。大黄素对照品（药品生物制品检定所，批号：110757-200206），甲醇（色谱纯）；磷酸(分析纯)，水为重蒸水。复方青骨凝胶（本院自制，批号：060603，060819，061103，070314，070723，070805）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱： Waters Xterra RP18(3.9 mm×150 mm,5.0 μm)；流动相为甲醇?水?磷酸（体积比80∶20∶0.1）；检测波长：440 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。在此色谱条件下，大黄素的保留时间约为11.5 min。色谱图见图1。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取大黄素对照品8.81 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.352 4 mg/mL的大黄素对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取复方青骨凝胶约8.0 g置干燥锥形瓶中，加入甲醇15 mL，超声提取15 min，放冷至室温，过滤，滤液置50 mL量瓶中。重复超声提取3次，合并滤液并用甲醇定容至50 mL，混匀，溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性样品制备
按处方制备不含大黄药材的阴性样品，按“2.2.2”项方法制成阴性样品溶液。
A.大黄素对照品 B.样品 C.阴性样品
图1 高效液相色谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms of samples
2.3 标准曲线的制备
分别精密吸取大黄素对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件，分别进样10 μL，以大黄素的进样量(m)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，结果回归方程为：A＝2.48×106m-2.35×104(r＝0.999 9)，表明大黄素的进样量在0.352 4～1.762 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验
精密吸取大黄素对照品溶液(质量浓度为0.704 8 mg/mL)10 μL，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，结果其峰面积的RSD＝1.04％（n＝6）。
2.5 稳定性试验
精密吸取新配制的供试品溶液（批号：070314），每隔1 h进样10 μL测定，连续测定5次，测定结果的RSD＝1.08％（n＝5）。表明供试品溶液在5 h内稳定性良好。
2.6 重复性试验
取同一批样品（批号：070314）6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定含量，结果RSD＝1.83%（n＝6），表明本方法的重复性良好。
2.7 加样回收率试验
精密称取6份已知含量的样品(批号：070314，含量为0.090 1 mg/g)，每份约5.0 g，精密加入浓度为0.352 4 mg/mL的对照品溶液1.0 mL，按“2.2.2”项下“精密加入甲醇15 mL”起操作，同法制成供试液，在上述色谱条件下进样10 μL，按“2.8”项下方法测定、，结果见表1。大黄素的平均加样回收率为101.99％，RSD＝2.79%（n=6）。
表1 加样回收试验结果（略）
Tab.1 Recovery results(n=6)
2.8 样品含量测定
取不同批号样品按“2.2.2”项下方法制备供试液，在上述色谱条件下，分别精密吸取大黄素对照品溶液及供试品溶液各10 μL，进样，测定各自峰面积，按外标峰面积法计算样品中大黄素的含量。结果见表2。
表2 样品含量测定结果（略）
Tab.2 Results of sample determination(n=3)
3 讨论
3.1 ［1-6］报道，大黄素的检测波长为254 nm或440 nm。为确定本实验的检测波长，我们将大黄素对照品在200～600 nm进行扫描，结果发现，大黄素在254 nm和440 nm均有吸收，如图2，但供试品溶液在254 nm波长处色谱峰受杂质峰干扰较大，定量不准确，故本实验选择440 nm作为检测波长，从而排除杂质的干扰，且基线平直，分离度亦好。
3.2 本文采用甲醇作为提取溶剂，能很好地避免复方青骨凝胶中其他成分的干扰，被测组分与杂质分离良好。
3.3 实验中曾将样品分别超声2次、3次、4次后测定大黄素的含量，结果表明，超声2次时测得量稍低，而超声3次和4次，每次15 min后的测得量无明显差别，故本实验确定超声次数为3次，每次超声时间为15 min。
3.4 流动相的pH值对试验有较大影响［3］，甲醇与水亦能使之得到良好的分离，但大黄素表现不稳定，降低流动相的pH值可以使之得到改善。所以，我们文献［4］，在流动相中按0.1％的比例加入磷酸，即获得良好的分离效果。
3.5 本方法操作简便，灵敏度高，结果准确，可作为该制剂实际生产中质量控制的标准。
图2 紫外光谱图（略）
Fig.2 UV spectrum
【参考文献】
［1］ 赵珉，韩玉慧，魏霞，等.高效液相色谱法测定复方万年青胶囊中大黄素［J］.卫生工程学，2007，6（1）：39.
［2］ 梁发华，陈翠卿，何瑞卿.HPLC法测定大黄虫丸中大黄素和大黄酚的含量［J］.广东药学院学报，2006，17（2）：152-153.
［3］ 黄莎莎，李萍，周娟，等. HPLC法测定解毒降脂片中大黄素的含量［J］.华西药学杂志，2007，22（2）：233.
［4］ 郭澄，王文佶，江春霞，等.高效液相色谱法测定减肥降脂片中大黄酸、大黄素的含量［J］.中国药房，2003，14（4）：241.
［5］ 黎炳华，王蔚.RP?HPLC法测定胃肠静胶囊中大黄素和大黄酚的含量［J］.中草药，2003，34（7）：609.
［6］ 陈定一.高效液相色谱法测定大黄及其炮制品中总大黄素的含量［J］.中国中药杂志，1994，19（9）：538.
