小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱初步研究

                      作者：赖毅勤,刘峰,周宏兵,陈加林

【摘要】  目的 研究小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱。 方法 色谱柱为大连依立特ODS C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；以90%甲醇-水-0.2%H3PO4为流动相A，以20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4为流动相B，按一定比例配制，梯度洗脱；柱温为31 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为275.5 nm；分析时间为120 min。结果 初步建立了小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱，标定了19个共有指纹峰，并对7个共有指纹峰进行了标记。结论 该法建立的指纹图谱具有可靠性，可为进一步研究小叶榕叶水提物的质量标准提供依据。

【关键词】  小叶榕叶;指纹图谱；高效液相色谱法

　　Abstract:Objective To determine the HPLC fingerprints of the  aqueous extracts of Folium fici microcarpae.Methods The extracts was analyzed on an ODS C18 column (4.6 mm×250 mm,5 μｍ) using 90% methanol-water-0.2%H3PO4 as gradient elute A，20% tetrahydrofuran-water-0.2%H3PO4 as gradient elute B.The flow rate was 1 mL/min and column temperature 31 ℃. The detection wavelength was 275.5 nm. Results HPLC fingerprints of the aqueous extracts of Folium fici microcarpae was established. A total of 19 common peaks have been identified and 7 compounds which were separated from leaves could be found the relative peaks in chart.Conclusion The fingerprints are reliable,which could be used for quality control of the aqueous extracts of Folium fici microcarpae..

　　Key words:Folium fici microcarpae ;  fingerprints；HPLC

　　小叶榕叶是桑科植物榕属小叶榕Ficus microcarpa L.f.的干燥叶子，主要产于广东和广西［1］。小叶榕叶水提物浸膏作为咳特灵的主成分收载在部颁标准［2］中，用于哮喘和慢性支气管炎。目前的部颁标准，只对小叶榕叶水提物浸膏做了薄层鉴别，质量标准较简单。本文对小叶榕叶水提物浸膏进行了HPLC指纹图谱的研究，为进一步研究和制订小叶榕叶及其提取物HPLC指纹图谱奠定实验依据。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器
    　　
　　福立2000高效液相色谱仪:N2000色谱工作站，二元泵，柱温箱，紫外检测器。

　　1.2  试剂
   
　　试剂均为色谱纯，并用0.45 μm微孔滤膜过滤。 

　　1.3  对照品
    　　
　　苯甲酸、1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮、2-羟基苯甲酸、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、红花菜豆酸、4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸，均为作者从小叶榕叶水提物中分离得到的化合物，并经IR、EI-MS、NMR鉴定结构，纯度经HPLC检测大于98.5%。

　　1.4  药材
      
　　小叶榕叶水提物浸膏，白云山制药厂提供。

　　2  方法与结果

　　2.1  供试品溶液的制备
    　　
　　取小叶榕叶水提物浸膏约1 g，蒸馏水溶解后，乙醇醇沉使溶液醇浓度为50%［3］，滤除不溶物，挥除乙醇直至没有醇味，得滤液。滤液用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次［2］，得乙酸乙酯层浸膏。将乙酸乙酯层浸膏用适量的甲醇溶解，定容至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

　　2.2  对照品溶液的制备
    　　
　　取各对照品适量，甲醇溶解后，定容至1 mL，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

　　2.3  检测波长的选择
   
　　取按“2.1”项方法制备的供试液进行紫外扫描，所得图谱见图1。从图1可见，275.5 nm处有最大吸收峰，故确定275.5 nm为检测波长。

　　图1  小叶榕叶供试液的紫外扫描图（略）

　　Fig.1  UV chromatogram of the aqueous extract of Folium fici microcarpae

　　2.4  色谱条件
   
　　色谱柱为大连依立特ODS C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）； 流动相：以90%甲醇-水-0.2%H3PO4为流动相A，以20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4为流动相B，按表1比例配制进行梯度洗脱；柱温为31 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为275.5 nm；分析时间为120 min；进样量为20 μL。
 
　　表1  梯度洗脱表（略）

　　Tab.1  Gradient elution time

　　2.5  方法学考察　

　　2.5.1  空白试验  吸取溶剂20 μL，按“2.4”项条件进样测定，记录色图谱，结果见图2。从图2可见，溶剂对测定无干扰。

　　图2  空白试验（略）

　　Fig 2  HPLC chromatogram of the blank assay

　　2.5.2  精密度试验  取同一份供试品溶液，连续进样5次，比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1 min内，RSD在0.2%～0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在0.7%～2.7%之间，表明共有峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均符合指纹图谱检测要求［4］。

　　2.5.3  稳定性试验  取同一份供试液，分别在0、2、4、6、24 h进样测定，比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1 min内，RSD在0.3%～0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在0.8%～2.9%之间。表明供试液在24 h内稳定，符合指纹图谱检测要求［4］。

　　2.5.4  重现性试验  取同一批小叶榕叶水提物浸膏，按“2.1”下制备5份供试液，分别进样测定，比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1min内，RSD在0.3%～0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在1.2%～2.8%之间，表明共有峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD符合指纹图谱检测要求［4,5］。

　　2.6  指纹图谱及技术参数

　　2.6.1  共有指纹峰的标定  取3批小叶榕叶水提物浸膏，对其HPLC指纹图谱做初步考察，初步确定了19个分离度较好且峰面积稳定的峰为共有峰。结果见图3。

　　图3  小叶榕叶提取物浸膏的指纹图谱（略）

　　Fig.3  HPLC fingerprints of the  aqueous extracts of Folium fici microcarpae

　　2.6.2  共有指纹峰的相对保留时间  根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，确定平均保留时间为44.643 min的8号共有峰为内标参照峰，其余18个共有指纹峰与参照峰相比，相对保留时间依次为：0.1283、0.1459、0.1610、0.2628、0.3947、0.4878、0.7581、1.1026、1.3346、1.6920、1.7398、1.8135、1.8807、1.8946、2.0636、2.0788、2.1154、2.1421。

　　2.6.3  共有指纹峰的相对峰面积  根据初步研究，共有峰面积占总峰面积比值为66.310%～80.094%。保留时间小于30 min的共有峰：单峰面积占总峰面积大于10％而小于20％的共有峰为5号，其相对峰面积比值为0.9102～0.9717，差值小于±25％。保留时间超过30 min的共有峰：单峰面积占总峰面积大于10％而小于20％的共有峰为7号和8号，7号峰的相对峰面积比值为0.5915～0.6725，其差值小于±25％。结果符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》。

　　2.7  部分共有峰的标记
   
　　取各对照品溶液20μL，分别注入高效液相色谱仪，HPLC色谱图见图3。结果确认了以下7个共有峰：11号峰为苯甲酸（75.332 min），12号峰为1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮（77.298 min），7号峰为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸（32.865 min），内标参照峰为4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸（43.832 min），6号峰为4-羟基苯甲酸（21.232 min），16号峰为红花菜豆酸（91.398 min），5号峰为4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸（17.165 min）。

　　3  讨论

　　3.1  目前国内中，一般都以总黄酮作为咳特灵中小叶榕叶水提物的质量指标，用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法［3］，或以槲皮素为对照品，用紫外分光光度法在265 nm处［5］测定其总黄酮含量。但作者从小叶榕叶分离得到的7个化合物，通过HPLC检测均为含量较大的共有峰，均不是黄酮类化合物。另外，文献［6～8］报道，在小叶榕叶中甲醇提取物中分离出的42个化合物中也仅有3个黄酮类化合物。Al(NO3)3-NaNO2-NaOH的黄酮专属性不强，一些具有邻二酚羟基的非黄酮物质也会发生反应［8］。分别称量对照品1至7，每个化合物约0.0003 g。将这7个化合物混合后，用甲醇溶解，定容至10 mL。取少量混合液作为空白对照进行紫外扫描，结果见图4。吸取6 mL混合液置25 mL的容量瓶中，加1 mL质量分数为5%的NaNO2，摇匀,放置6 min，再加1 mL质量分数10%的Al(NO3)3，摇匀,放置6 min，最后加1 mL质量分数4%的NaOH，加水至刻度,摇匀。加入NaOH后观察到溶液从透明无色变为黄色。在15 min内对反应液进行紫外扫描，结果见图5。两图比较,反应后的溶液在500 nm处有明显吸收,而反应前的空白液在500 nm处则无吸收。说明从小叶榕叶中分离得到的化合物，混合后也能发生Al(NO3)3-NaNO2-NaOH反应。综上所述，作者认为以总黄酮作为小叶榕叶水提物浸膏的质量指标，用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法进行测定的方法是否合理，值得进一步探讨，建立其HPLC指纹图谱可能更。

　　图4  空白对照紫外扫描图（略）

　　Fig.4  UV chromatogram of blank assay

　　图5  反应后紫外扫描图（略）

　　Fig.5  UV chromatogram of reaction

　　3.2  由于条件和时间限制，本文只对3批小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱做了初步研究，共有峰面积占总峰面积的平均比值为73.247%，暂未达到《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中非共有峰总面积不得大于总峰面积10％的要求。今后将收集不同产地的小叶榕叶作进一步的研究。

【文献】
  　　［1］ 江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社,2001:2528-2529.

　　［2］ 中华人民共和国卫生部.WS3-B-2742-97 咳特灵片［S］.

　　［3］ 叶荣科,张德志,周宏兵,等.小叶榕树叶总黄酮水提醇沉工艺研究［J］.广东药学院学报，2003,19(4):330-331.

　　［4］ 蔡宝昌,刘训红.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术［M］.北京:化学出版社, 2005:1-18,23.

　　［5］ 贾茹冰.咳特灵胶囊中小榕树膏总黄酮的含量测定［J］.广西中医学院学报,2000,17(4):65-66.

　　［6］ 林焕祐.正榕叶部之成分研究［D］.大学，2003.

　　［7］ KUO Yueh-Hsiung,LIN Huan-you.Two novel triterpenes from the leaves of ficus microcarpa［J］. Helvetica Chimica Acta,2004,87(5):1071-1076.

　　［8］ 郭亚健,范莉,王晓强,等.关于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志，2002,22(2):97-98.