Lewis全细胞肿瘤疫苗防治C57BL/6小鼠Lewis肺癌的实验研究
【摘要】 目的 探讨Lewis全细胞肿瘤疫苗对小鼠Lewis肺癌的防治作用。方法 用Lewis全肿瘤疫苗免疫C57小鼠4次,其中首次免疫用含弗氏佐剂油剂疫苗，第4次免疫的同时在小鼠右腋下接种Lewis肺癌细胞，定期观察小鼠成瘤情况及小鼠免疫状态变化。用流式细胞术检测疫苗组和对照组小鼠外周血CD4+T细胞，CD8+T细胞及CD19+B细胞百分比，以及CD4/CD8的变化。结果 疫苗组与对照组小鼠成瘤率、成瘤时间、肿瘤大小差异均无显著性；疫苗组与对照组相比，其外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比差异无显著性，CD4/CD8比值的差异也无显著性,疫苗组外周血CD19+B淋巴细胞百分比略高于对照组，差异有显著性（P=0.014）。结论 用Lewis肿瘤全细胞疫苗不能提高C57BL/6小鼠的T淋巴细胞免疫功能，可以提高其B淋巴细胞免疫，但不能使小鼠获得有效的免疫保护。
【关键词】 肺癌；肿瘤细胞疫苗；流式细胞术；Lewis 肺腺癌细胞
Abstract:Objective To observe the tumor formation and the efficacy of immune response of C57BL/6 mice after the mice were inoculated an autologous tumor?cell vaccine against Lewis lung carcinoma.Methods Two groups of mice (vaccine group and control group) were inoculated, totally 4 times. When the third vaccine was inoculated, the mice were injected with Lewis lung tumor tissue suspension at right axillary subcutaneously region at the same time. Then tumor formation was observed. The subsets of the lymphocytes (CD4+?T cell, CD8+?T cell and CD19+?B cell) in peripheral blood of the two groups of mice were also assayed with flow cytometry. Results Two groups of mice have the same rate of tumor?formation (100%).And there is no significant difference in time of tumor?formation and tumor volume between the two groups.Contrasted with the control group, the vaccine group shows no significant difference in the subsets of the lymphocytes in peripheral blood. Conclusion This study indicates that the Lewis autologous tumor?cell vaccine can enhance B?cell but not T?cell immune responses and cannot protect mice from tumor challenge.
Key words:lung cancer; cancer vaccine; immunotherapy；mice
肺癌是严重危害人类健康的重大疾病，其发病率及病死率在国内外均呈逐年上升趋势。肺癌的除手术、放疗和化疗外,近年的研究热点——肿瘤疫苗免疫治疗则被人们认为是治疗肺癌的第4种重要措施。肿瘤的主动特异性免疫治疗是免疫治疗中极具吸引力的治疗方法［1］。虽然国内外有关实验研究相继建立了一系列在动物模型中被证明有效的细胞瘤苗设计方案,但在临床上所取得的疗效有限［2,3］。因此肿瘤细胞疫苗是否能引起机体的特异性免疫反应，进而提高机体抗肿瘤效应，仍有待进一步的实验研究。本研究采用Lewis肺腺癌细胞株制成全细胞肿瘤疫苗，免疫C57小鼠后观察该肿瘤疫苗对C57小鼠的免疫防治效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实动物及分组 近交系C57BL/6小鼠20只，雌雄各半，6～7周龄，体质量15～18 g, SPF级，合格证号：SCXK（粤）2006-0015 2006B023 2006A046，由南方医科大学实验动物中心提供。小鼠随机分为疫苗组和对照组，每组各10只。
1.1.2 瘤株 Lewis肺腺癌细胞株(LLC, 为C57BL/6小鼠源性肺腺癌细胞），购自院上海细胞生物研究所细胞库。瘤细胞培养于Dulbecco′s modified Eagle′s medium Dulbecco（DMEM）高糖完全培养液中。
1.1.3 试剂 完全弗氏佐剂，购于SIGMA公司。
1.2 方法
1.2.1 LLC肿瘤细胞悬液制备 取处于对数生长期的LLC细胞接种于C57BL/6小鼠右腋皮下，成瘤后于无菌条件下取局部肿瘤组织并称重，将瘤组织(g) 与生理盐水(mL) 以1∶10的比例混合成匀浆（计数板计数瘤细胞约为1×106/mL）。
1.2.2 疫苗组小鼠免疫 将处于对数生长期的LLC细胞，用2.5%胰酶消化后，重悬于含10%(φ)小牛血清的DMEM培养液中, D?HANK’S液洗涤3遍，调整细胞数为2×107/mL,置室温和-20 ℃反复冻融5次以灭活细胞［4］。用2只注射器分别抽取完全弗氏佐剂与灭活细胞，体积比为1∶1,再用三通管将其连接，乳化30 min，作为疫苗组油剂疫苗。乳化效果以乳化液滴于水中2 h无扩散为标准。每只小鼠左前肢及左后肢各肌注疫苗50 μL，每周1次，共4次。第1次为含弗氏佐剂油剂疫苗，第2、3、4次为单纯灭活细胞+生理盐水水剂疫苗。第4次免疫时同时于小鼠右腋下接种LLC肿瘤细胞悬液0.2 mL。
1.2.3 对照组小鼠免疫 用2只注射器分别抽取完全弗氏佐剂与生理盐水，体积比为1∶1,再用三通管将其连接，乳化30 min，作为对照组油剂疫苗。乳化效果以乳化液滴于水中2 h无扩散为标准。每只小鼠左前肢及左后肢各肌注疫苗50 μL，每周1次，共4次。第1次为含完全弗氏佐剂油剂疫苗，第2、3、4次为单纯生理盐水。第4次免疫时同时于小鼠右腋下接种LLC肿瘤细胞悬液0.2 mL。
每日观察小鼠成瘤情况，记录成瘤时间，小鼠成瘤率。自接种第10日起，每2日直尺测量每只小鼠腋下肿瘤长径（L）和短径（W），用Still公式计算肿瘤体积,V=LW2/2［5］。
1.2.4 T、B细胞亚群的检测 疫苗组及对照组小鼠于接种LLC肿瘤细胞前一天采血。小鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥钠0.1 mL，麻醉生效后用眼眶采血法采血0.3 mL，肝素钠抗凝。检测时取2只试管,各加抗凝全血100 μL后一管加入CD3?PE抗体、CD4?FITC抗体和CD8?PE?CY5抗体各20 μL,另一管加入CD19? FITC抗体20 μL,室温下避光反应15 min,再加入2 mL溶血剂,室温下作用10～15 min,待完全溶血后,离心,去上清, PBS洗2次,加入500 μL PBS重悬细胞,立刻上流式细胞仪检测。
1.3 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件,对成瘤率进行Fisher’s精确概率检验，对肿瘤大小、淋巴细胞亚群检测数据行两独立样本t检验，两组小鼠生存率的变化采用Kaplan?Meier法进行生存分析，两组间生存率差异显著性检验用Log rank 检验，以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 Lewis肿瘤细胞疫苗对C57小鼠接种Lewis肺癌细胞的免疫预防作用 观察免疫,小鼠肌注肿瘤疫苗4次,随后右腋皮下接种Lewis肺癌细胞，7 d后免疫组及对照组小鼠全部成瘤，成瘤率为100%（见表1），没有小鼠获得保护。其中免疫组小鼠平均成瘤时间为7.8 d，对照组小鼠平均成瘤时间为8.1 d，两者比较差异无显著性（P=0.320）。疫苗组和对照组小鼠中位生存时间均为33 d，两者比较差异无显著性（P=0.669），见图1。这些结果提示Lewis肿瘤细胞疫苗对C57小鼠不具备预防Lewis肿瘤生长的作用。
表1 经免疫后的小鼠皮下接种Lewis 肺癌细胞的成瘤实验结果（略）
Tab.1 Tumor formation after the inoculated with LLCs in immunized C57BL/6 mice
*肿瘤体积为接种后第18天的测量结果
图1 两组小鼠的生存曲线图（Kaplan?Meier法）（略）
Fig.1 Survival functions of two groups（Kaplan?Meier method）
2.2 小鼠外周血T、B淋巴细胞亚群检测结果 疫苗组小鼠与对照组小鼠相比其外周血的CD4+T细胞及CD8+T细胞之百分比无明显改变，差异无显著性，CD4+/ CD8+比值的变化差异也无显著性；疫苗组外周血中CD19+B淋巴细胞百分比高于对照组，差异有显著性（P=0.014）。提示Lewis肿瘤细胞疫苗增强了C57BL/6小鼠的体液免疫反应，但不能增强其细胞免疫反应，见图2、3。
图2 小鼠外周血T、B淋巴细胞亚群检测结果（略）
Fig.2 T Cells and B cells were analyzed in peripheral blood of the vaccine group and the control group of mice
图3 小鼠外周血中T、B淋巴细胞百分比（略）
Fig.3 Percentage of T cells and B cells in peripheral blood
3 讨论
随着对肿瘤免疫研究的深入，肿瘤免疫已成为当今肿瘤治疗的研究热点之一。肿瘤细胞疫苗是肿瘤免疫治疗的一个重要组成部分［6］。人们认为可以通过肿瘤( 抗原) 疫苗来提高机体免疫系统对肿瘤的识别和排斥，进而达到抗肿瘤的作用。灭活的肿瘤细胞理论上能提供肿瘤细胞的所有抗原, 包括特异性抗原和广谱性抗原,用其免疫机体后可使使机体形成特异性抗肿瘤免疫应答［7］。通常采用在疫苗中加入诱导免疫反应的免疫佐剂，借此来达到增强疫苗免疫原性的目的［8］。
齐旭［9］等应用完全弗氏佐剂及rhIL?2+rmGM?CSF混合肿瘤细胞制成自体肿瘤疫苗,对荷瘤小鼠进行主动免疫治疗，免疫组小鼠生存期较对照组显著延长。但是文中提到的对照组接种的免疫剂为Hank’s 平衡盐溶液，这一对照不能排除免疫组生存期的延长是由佐剂增强了机体的非特异性免疫所致。彭宝岗等［10］采用多聚甲醛固定的小鼠肝癌细胞混合粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子和白介素?2 缓释微球为免疫激活剂作为肿瘤疫苗, 接种小鼠后, 80 %小鼠获得保护，但同样不能证实其保护作用是由肿瘤疫苗引起的特异性免疫应答所致。
本实验中所用的完全弗氏佐剂是由矿物油、水及灭活的结核杆菌混合而成的油性乳剂。完全弗氏佐剂是Th1亚型细胞的强有力激活剂，能增强机体的细胞免疫和体液免疫反应,但是因其可引起组织坏死、溃疡等副作用，限制了其临床应用。本实验中第一次免疫采用油剂疫苗（即完全弗氏佐剂+肿瘤细胞），其后3次加强免疫均单用肿瘤细胞，以减轻组织坏死等副作用。观察小鼠接种疫苗后，部分接种部位有硬结，但无坏死及溃疡。
本实验与以往实验的不同之处在于，所采用的细胞系为C57BL/6小鼠来源，排除了种属间及同种异体间的免疫排斥反应。应用完全弗氏佐剂与Lewis肺腺癌细胞乳化制成自体肿瘤细胞疫苗，对小鼠进行多次多部位免疫后，再用Lewis肺腺癌细胞攻击小鼠，其成瘤率、成瘤时间、小鼠的生存期较对照组差异均无显著性。流式细胞术检测小鼠外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞的百分比，疫苗组与对照组比较，疫苗组CD19+B细胞百分比高于实验组，差异有显著性（P=0.014）。CD4+ T细胞及CD8+ T细胞百分比、CD4+/CD8+比值差异无显著性。这提示此疫苗及此种免疫方案虽然能增强小鼠的体液免疫反应，但是没能增强小鼠的细胞免疫反应，不能使小鼠获得有效的免疫保护。究其原因，自体肿瘤细胞的低免疫原性是一方面；另一方面，有大量的实验研究表明所有的肿瘤，不论是诱发还是自发，其主要组织相容性抗原总是严格地与其来源的机体组织保持一致，而肿瘤所具有的特异性抗原为弱的组织相容性抗原，只能诱发一定程度的免疫排斥反应，在临床上只表现为不同程度的肿瘤所在部位的淋巴细胞浸润，不能完全排斥肿瘤［11,12］。各种用于增强肿瘤免疫原性的手段，如佐剂，只能增强机体对肿瘤的非特异性免疫，并没有改变肿瘤的主要组织相容性抗原，因此不能完全有效地排斥并杀灭肿瘤细胞。这提示依靠肿瘤细胞疫苗的特异性免疫反应来防治肿瘤的前景并不如人们预想的乐观。但是，通过细胞因子等方法提高机体非特异性免疫反应的各种治疗肿瘤的方法，值得继续深入研究。通过肿瘤细胞免疫，能提高机体对肿瘤细胞的体液免疫反应，又为探讨肿瘤的免疫治疗问题提供了新的切入点。
【】
［1］ GERARD C M, BAUDSON N, KRAEMER K, et al. Recombinant human papillomavirus type 16 E7 protein as a model antigen to study the vaccine potential in control and E7 transgenic mice ［J］.Clin Cancer Res,2001,7(3):838-2847.
［2］ ZUM BUSCHENFELDE C M, METZGER J, Hermann C, et al. The generation of both T killer and TH cell clones specific for the tumor-associated antigen HER2 using retrovirally transduced dendritic cells［J］.J Immunol,2001,167(3): 1712 -1719.
［3］ KURIYAMA H, SHIMIZU K, LEE W, et al. Therapeutic vaccine generated by electrofusion of dendritic cells and tumour cells［J］. Dev Biol (Basel),2004,116: 169-78.
［4］ 杨威，潘承恩，曹春霞，等. 新型全细胞瘤苗对荷肝癌小鼠的主动免疫治疗［J］. 细胞与分子免疫学杂志,2002,18(1):43-45.
［5］ ROSATO A, ZOSO A, DALLA SANTA S,et al. Predicting tumor outcome following cancer vaccination by monitoring quantitative and qualitative CD8+ T cell parameters［J］.Immunol,2006,176(3):1999-2006.
［6］ WARD S, CASEY D, LABARTHE M C, et al.Immuno?therapeutic potential of whole tumour cells［J］.Cancer Immunol Immunother,2002,51(7): 351-357.
［7］ HUMPHREYS R E, HILLMAN G G, VON HOFE E, et al. Forcing tumor cells to present their own tumor antigens to the immune system: a necessary design for an efficient tumor immunotherapy ［J］.Cell Mol Immunol,2004,1(3):180-185.
［8］ BERD D, SATO T, COHN H, et al. Treatment of metas?tatic melanoma with autologous,hapten?modified melanoma vaccine: regression of pulmonary metastases［J］.Int J Cancer,2001,94(4):531-539.
［9］ 齐旭, 周伊,王一理,等. 同系细胞瘤苗对低免疫原性小鼠黑色素瘤治疗作用的研究［J］.肿瘤生物治疗杂志,2002,9(1): 60-61.
［10］ 彭宝岗，梁力建，何强，等. 自体肿瘤疫苗治疗肝癌的实验研究［J］. 中华肝胆外科杂志, 2005,11(8)：551-554.
［11］ ROSENBERG S A, SPIESS P, LAFRENIERE R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor?infiltrating lymphocytes ［J］.Science, 1986,233(4770):1318-1321.
［12］ REINIS M, SIMOVA J, INDROVA M, et al. Immuni?zation with MHC class I?negative but not positive HPV16?associated tumour cells inhibits growth of MHC class I?negative tumours［J］. Int J Oncol,2007,30(4):1011-1017.
