大豆异黄酮苷元检测方法的研究

                作者：张磊,金桂芳,杨红,习志刚 

【摘要】  目的 建立大豆异黄酮苷元含量测定方法。方法 采用HPLC法，Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相：甲醇-0.3%磷酸溶液（体积比48∶52），流速0.7 mL/min，测定波长260 nm,柱温25 ℃。结果 制备的大豆异黄酮苷元总含量为70.98%;大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率分别为98.7%、98.9%和99.2%，RSD分别为2.1%、1.6%和1.4%。结论 所建立的测定方法重现性好、可靠，可用于3种大豆异黄酮苷元的含量测定。

【关键词】  大豆异黄酮苷元；高效液相色谱法；含量测定

　　Abstract:Objective To establish an HPLC method for the content determination of isoflavone aglycones. Methods Isoflavone aglycones were analyzed on a  Diamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm，5 μm). A mixture of MeOH-0.3%H3PO4（48∶52) was used as the mobile phase with a flow rate of 0.7 mL/min. The detecting wavelength was 260 nm at 25 ℃.Results The content of  isoflavone aglycones in the sample was 70.98%.The average recoveries of genistein,daidzein and glycitein were 99.2%,98.7% and 98.9% with  RSD 1.4%,2.1% and 1.6%,respectively. Conclusions  This method can be used for the quality control of soy isoflavone aglycones.

　　Key words:soy;isoflavone aglycones； HPLC

　　大豆异黄酮有广泛的生理活性，具有抗氧化、防癌和抗癌、预防骨质疏松症、保护心血管系统和神经保护等作用。有资料表明，在哺乳动物体内，去除糖基配体后形成的大豆黄酮苷元及其代谢产物均是弱雌激素样活性物质,苷元比糖苷更容易被人体吸收［1,2］。大豆异黄酮苷元广泛用于保健品、食品和化妆品等，正受到广泛的关注，因此建立一个稳定、准确的含量检测方法有重要的应用价值。

　　1  仪器与材料
    　 
　　Dionex P680A高效液相色谱仪，数显恒温水浴锅（江苏省宏华仪器厂），旋转蒸发器(上海亚荣仪器厂)，SH2-D循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），天平（Sartorius）。
    　　
　　染料木素、大豆苷元和黄豆黄素对照品 (购于上海同田生化技术有限公司,纯度均≥99%)，脱脂豆粕（购于山西省曲沃县），AB-8大孔树脂（南开大学化工厂），聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；甲醇(色谱纯,英国TEDIA公司)，屈臣氏蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  大豆异黄酮苷元的制备  　　取豆粕适量，用8倍量（g/mL）体积分数为70％的乙醇溶液浸泡30 min，80  ℃水浴回流提取2次，每次90 min；合并提取液，过滤后回收乙醇、浓缩；上AB-8大孔树脂,以体积分数为50％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，45  ℃烘干。适量乙醇溶液溶解，拌样上聚酰胺柱，以体积分数为70％的乙醇溶液洗脱，得粗提浸膏，45 ℃烘干。取一定量的粗提物置于圆底烧瓶中，加入4倍量（g/mL）的7%盐酸-乙醇液，80  ℃水浴水解2 h，浓缩，乙醚萃取，挥干乙醚；用适量体积分数为70％的乙醇溶液溶解，石油醚脱脂，用200～300目硅胶拌匀，干燥，上硅胶柱，用三氯甲烷-甲醇（体积比6∶1）洗脱，收集洗脱液，挥去溶剂，得大豆异黄酮苷元混合物［3,4］。

　　2.2  样品溶液的制备  　　精密称取大豆异黄酮苷元混合物28.50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0.0570  mg/mL的样品溶液。

　　2.3  对照品溶液的制备  　　分别精密称定大豆苷元、染料木素对照品13.20 mg、14.60 mg各置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，得浓度为0.264 0  mg/mL的大豆苷元及0.292 0  mg/mL的染料木素对照品溶液；精密称定黄豆黄素27.75 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取1.0 mL，至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得0.111 0  mg/mL的黄豆黄素对照品溶液。4  ℃储存备用。

　　2.4  色谱条件［5～6］  Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温25 ℃；流动相：甲醇-0.3%磷酸溶液（体积比48∶52）；流速=0.7 mL/min ；测定波长260 nm；进样量：20 μL。  

　　2.5  线性关系       分别精密吸取上述大豆苷元、染料木素、黄豆黄素对照品溶液0. 8、1.5、0.6 mL置100 mL量瓶中，甲醇定容，得混合对照品溶液Ⅰ。同法制备混合对照品溶液Ⅱ-Ⅵ，浓度见表1，混合对照品HPLC色谱图见图1。

　　表1  混合对照品溶液中大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的质量浓度 （略）

　　Tab.1  Contents of genistein,daidzein and glycitein in the control sampleρ/

　　按上述色谱条件依法测定，分别以大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的浓度(μg/mL)对峰面积作回归,得回归方程（n＝6）分别为：
    y=5836.1x+0.8812，r=0.9994；
    y=1177.4x+0.1372，r=0.9994；
    y=3256.6x+0.894，r=0.9992。
    大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在2.112～21.12 μg/ mL，0.666 0～6.66 0 μg/mL,4.380～43.80 μg/mL范围内，线性关系良好。

　　1.大豆苷元  2.黄豆黄素  3.染料木素

　　图1  对照品HPLC色谱图（略）

　　Fig.1  HPLC chromatogram of reference substance

　　2.6  精密度试验       取对照品溶液Ⅲ，重复进样6次，记录色谱图，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为0.5９%、 0.6２%和0.8３%。

　　2.7  重复性试验  　　取同一批次大豆异黄酮苷元混合物6份，按“2.2”项下，制备样品溶液，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为2.0%，1.2%和1.4%。

　　2.8  稳定性试验       取同一样品溶液分别在0、2、4、6、8、12 h于上述色谱条件下测定峰面积值，RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为0.70%、1.4%  和0.74%。

　　2.9  回收率试验  　　取大豆异黄酮苷元混合物6份，精密称定，分别准确加入3种对照品溶液各适量，余同“2.2”项下操作。分别计算得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率，结果见表2、表3、表4,结果表明，3种苷元回收率均符合要求。

　　2.10  大豆异黄酮苷元含量测定  精密吸取样品溶液（0.171 mg/mL），测定3次，结果见表3,样品中３种苷元总质量分数为70.98%,样品HPLC图见图2。

　　表2  大豆苷元加样回收率实验结果（略）

　　Tab.2  Recovery results of daidzein（n＝6）

　　表3  黄豆黄素加样回收率实验结果（略）

　　Tab.3  Recovery results of glycitein（n＝6）

　　表4  染料木素加样回收率实验结果（略）

　　Tab.4  Recovery results of genistein（n＝6）

　　表5  样品含量测定结果（略）

　　Tab.5  Results of sample determination（n＝3）

　　1.大豆苷元  2.黄豆黄素  3.染料木素

　　图2  样品HPLC色谱图（略）        

　　Fig.2  HPLC chromatogram of the sample

　　3  讨 论
       
　　大豆中异黄酮存在的形式主要是结合型的糖苷,其含量占大豆中异黄酮含量的95%以上,虽然游离的苷元含量不足5%,但它们表现出来的活性要比结合型的糖苷高得多。在用水解法制备大豆异黄酮苷元时，常用酶、碱和酸法水解。酶水解条件要求高、成本高，碱性条件水解得到异黄酮苷元不稳定，容易降解，本试验用酸水解，而常用强酸中,硫酸、硝酸有氧化性，可能破坏异黄酮苷元上的酚羟基，所以本试验选用盐酸。
       
　　本实验分别考察了不同体积比的甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸，乙腈-水作为流动相，结果显示甲醇-磷酸，且流速为0.7 mL/min时,可使大豆苷元、黄豆黄素和染料木素3种苷元达到基线分离，也可使大豆苷、染料木苷和上述3种苷元共5种成分达到基线分离；豆粕提取物中有油脂，样品用石油醚脱脂后，测定干扰少，效果理想。
    　　
　　本文采用高效液相色谱法同时测定3种大豆异黄酮苷元的含量，结果准确、可靠，为大豆异黄酮苷元产品的生产制备及推广应用提供了支持。

【】
  　　［1］ 张逊，姚文，朱伟云.肠道大豆异黄酮降解菌研究进展［J］.世界华人消化杂志，2006，14（10）：973-978.

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