复方黄芪肠宁灌肠剂中三七提取工艺的优选

                  作者：张潮林，李勇，曾育君，沈雪梅  

【摘要】  目的 优选复方黄芪肠宁灌肠剂中三七的最佳提取工艺。方法 采用正交试验设计，用高效液相色谱法测定提取液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量，优选三七药材的提取工艺条件。结果 优选的工艺为70%的乙醇6倍量，提取3次，每次1.0 h。结论 优选的提取工艺三七总皂苷提取率高，适用于生产。

【关键词】  三七；三七总皂苷；复方黄芪肠宁灌肠剂；正交试验；提取工艺

　　Abstract:Objective To optimize the extraction procedure of total saponins from Radix notoginseng for compound Huangqi Changning enemA.Methods Orthogonal test was employed for optimizing the extraction processes by the indexes of the contents of ginsenoside Rg1,ginsenoside Rb1 and  notoginsenoside R1.Results Six volumes of 70% alcohol,3 times of extraction processes with 1.0 hour for each time were considered as the optimum extraction technology.  ConclusionThis extraction procedure of active components in the drugs is achieved by applying the selected technology.

　　Key words:Radix notoginseng; total saponins; compound Huangqi Changning enema; orthogonal design; extraction technology

　　复方黄芪肠宁灌肠剂由黄芪、三七、补骨脂、仙鹤草等组成，具有益肾健脾、化湿清热、通经生肌的功效，用于溃疡性结肠炎。临床用煎煮液保留灌肠给药，三七以细粉加入灌肠液中。但细粉的颗粒对肠道黏膜产生刺激，引起排便感，导致灌肠液在肠道内的保留时间缩短，降低药效。本文采用正交试验设计，以提取液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量为指标，优选三七药材的提取工艺条件，为生产更方便、有效的制剂提供依据。

　　1  仪器与试药
    　　
　　高效液相色谱仪（WATERS2695/2996）。
    　　
　　三七为五加科植物Panax notoginseng (Burk）F.H.Chen 的干燥根及根茎，购自广州致信中药饮片有限公司，经测定［1］，符合《药典》2005年版（一部）三七项下的规定，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1三者质量分数之和为8.86%。
    　　
　　人参皂苷Rb1（110704－200420)、人参皂苷Rg1（110703－200424)、三七皂苷R1（110745－200415）均为中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果
    　　
　　三七中所含三七皂苷R1、R2，人参皂苷Rb1、Rd、Rg1等皂苷类成分（以下简称总皂苷，PNS）为其主要活性成分［2］，此类成分溶于甲醇、乙醇和水。经预实验，以水为溶剂，将三七与方中群药共煎，总皂苷转移率只有30%，因此，确定三七单独提取。分别采用水和体积分数为70%的乙醇为溶剂提取，水为溶剂提取的总皂苷为乙醇提取量的52.6%。初步药效学实验表明，三七的乙醇提取液与群药水提液的混合液，对实验动物溃疡性结肠炎有明显的改善作用［3］，故确定以乙醇为溶剂，采用正交试验法，优选三七的提取工艺条件。

　　2.1  三七总皂苷含量测定［1］

　　2.1.1  色谱条件  色谱柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：０～９０ min，流动相A从１９％到３６％，流动相Ｂ从８１％到６４％；流速：1 mL·min-1；进样量：15 μL；柱温：28 ℃；检测波长：203 nm。三七皂苷R1峰、人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Rb1峰的保留时间分别是23.18 min、28.54 min、83.90 min。见图1。

　　A.对照品  B.样品

　　图１  三七的高效液相色谱图（略）

　　Fig.1  HPLC chromatograms of Radix notoginseng 

　　2.1.2  标准曲线的绘制  精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg1 1.071 mg、人参皂苷Rb1 0.994 mg、三七皂苷R1 0.518 mg的混合溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液3、5、10、20、25、30 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1微克数为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），回归方程。人参皂苷Rg1：Y=274278.66Y－81840.47(r=0.9999)，线性范围1.285～12.852 μg；人参皂苷Rb1：Ｙ=216171.23X－125333.54(r=0.9997)，线性范围1.193～11.928 μg；三七皂苷R1：Ｙ=239798.93X－38810.58(r=0.9999)，线性范围0.622～6.216 μg。

　　2.2  粒径考察
    　　
　　三七质地坚硬，粒径对药物成分的提取率有一定的影响。故以总皂苷提取率为指标，对其粒径与得率的关系进行考察。

　　2.2.1  供试品溶液的制备  分别称取三七最粗粉、粗粉、中粉各30 g，精密称定，加体积分数为70％的乙醇7倍量，回流提取2次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，分别定容至500 mL，作为样品溶液。精密移取各样品液2 mL水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至10 mL量瓶中，作为供试品溶液。

　　2.2.2  含量测定  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各15 μL，注入液相色谱仪中，按“2.1.1”项下条件，测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面积积分值，计算，结果见表1。

　　表1  粒径对提取率的影响（略）

　　Tab.1  Effects of particle size on extraction efficacy

　　实验结果表明，粗粉的三七总皂苷提取率较高，故确定三七药材粒度为粗粉。

　　2.3  正交试验
    　　
　　根据预试验结果，在确定了溶剂与药材粒度的基础上，以PNS提取量为指标，采用L9(34)正交试验，对影响提取的乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间、提取次数等因素进行考察。实验设计见表2，实验结果见表3，方差分析见表4。

　　表2  因素水平表（略）

　　Tab.2  Factors  and  levels

　　比较各因素的极差值可以看出，影响提取效果的因素顺序为D＞A＞B＞C。方差分析，乙醇体积分数、乙醇用量与提取次数对提取效果有显著影响，优选的条件为A2B3C3D3，即乙醇体积分数为70%、6倍量，提取3次，每次1.5 h。

　　2.4  比较验证实验
    　　
　　由于提取时间是最小影响因素，且提取0.5 h与1 h无明显差异，故将提取时间定为1.0 h，提取次数采用3次，乙醇体积分数采用最佳体积分数（70%），乙醇用量分别按照6倍与7倍进行比较验证性试验。结果显示，乙醇用量采用6倍与7倍，提取液中三七总皂苷含量分别为82.75（mg/g）和83.63（mg/g），提取率均达95%，说明三七总皂苷提取完全。综合考虑生产成本、提取效率，确定三七提取工艺条件为A2B3C2D3，即70%乙醇6倍量、提取3次，每次1.0 h。

　　表3  正交试验结果（略）

　　Tab.3  Results  of  L9(34)  orthogonal  design

　　表4  方差分析结果（略）

　　Tab.4  Results  of  variance  analysis

　　F0.01(2,2)=99，F0.05(2,2)=19
   
　　3  讨论

　　3.1  通过粒径考察，采用三七粗粉（过24目筛，粒径800～300 μm）既保证了提取效率，又简化了粉碎步骤，降低了粉碎能耗，同时也减少了药物的损失。

　　3.2  按照优选的工艺条件提取三七，提取液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1含量之和按三七干燥品为8.0%左右，提取率达90%以上，表明提取完全，提取工艺合理可行。

【】
  　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：化学出版社，2005，10-11.

　　［2］ 甘雨，徐惠波，孙晓波.三七总皂苷的药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2007，18（5）∶1251-1252.

　　［3］ 张潮林，胡旭光，沈雪梅.复方黄芪肠宁颗粒提取工艺研究［J］.时珍国医国药，2007，18（3）∶574-575.