高效液相色谱法测定云威灵药材中百里香酚的含量

来源:岁月联盟 作者:林志云,潘利明 时间:2010-07-11

【摘要】  目的 建立云威灵药材中百里香酚的含量测定方法。方法 用高效液相色谱法,体积分数为95%的乙醇回流提取,色谱柱Symmetry C18,流动相乙腈-水 (体积比65∶35),检测波长274 nm。结果 百里香酚在0.04~1.23 mg (r=0.9999)有良好的线性关系;平均回收率百里香酚99.02%(RSD 1.03%),重复性百里香酚RSD 0.88%。结论 该方法可靠、便捷,可以作为控制云威灵药材质量的方法。

【关键词】  云威灵;百里香酚;高效液相色谱法

  Abstract:Objective To establish a quantitative method for determining the content of thymol in Inula nervosa Wall. Method The sample was extracted with 95% ethanol,then analyzed on a C18 column using acetonitrile-water (65∶35) as mobile phase. The detection wavelength was set at 274 nm.Result The linear range of thymol was 0.04~1.23 mg (r=0.9999),and the average recovery was 99.02% (RSD 1.03%).Conclusion The method is reliable and rapid for quality control of Inula nervosa Wall.

  Key words:Inula nervosa Wall;thymol;HPLC

  威灵仙是毛茛科植物威灵仙Clematis chinese Osbeck棉团铁线莲C.hexapetala Pall及东北铁线莲C.manshurica Rupr的干燥根及根茎,为祛风湿和止痛的常用中药[1]。长期以来其药材来源相当混乱,据考证,在全国有十余种植物均作威灵仙应用[2]。云南省的大部分地区,长期习用菊科旋覆花属植物显脉旋覆花(Inula nervosa Wall)作威灵仙入药。云南威灵仙又名铁脚威灵仙、黑威灵(《思茅中草药》),草威灵(《昆明民间常用草药》),小黑药、葳灵仙(《滇南本草》),黑根(《贵州民间药物》),铜脚威灵(《云南中草药选》)、威灵菊(《全国中草药汇编》),黑根药(四川),乌根草(广西)。其功用祛风湿,通经络,健胃消食,祛痰止咳。主治风湿骨痛,脚气水肿,感冒咳嗽,食滞腹胀噎膈,胃痛,高热,体虚多汗[3]。据报道,威灵仙中的主要成分百里香酚有较强的抑杀细菌、真菌的作用,且毒性低[2,4]。为有效地控制云威灵药材的质量,本文测定了不同产地和来源的样品,建立了用高效液相色谱法测定云威灵药材中百里香酚的方法。

  1  仪器与试药
      
  高效液相色谱仪:Waters 2690,Waters PAD 996紫外可见检测器、Precisa XS 125A型天平(瑞士产)。水为超纯水,乙腈为一级色谱纯,其他试剂均为分析纯。百里香酚(购于药品生物制品检定所 100508-200301)。药材经广东药学院中药鉴定教研室鉴定为菊科旋覆花属植物显脉旋覆花Inula nervosa Wall。

  2  方法与结果

  2.1  色谱条件
   
  色谱柱Symmetry C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相乙腈-水(体积比65∶35);检测波长274 nm;流速1 mL·min-1;理论板数按百里香酚峰不低于11 000。
      
  检测波长的选择:取百里香酚对照品1.0 mg至10 mL的容量瓶中,加体积分数为95%的乙醇至刻度使其溶解,配成溶液质量浓度为0.1 mg/mL的标准品溶液。取0.1 mg/mL的标准品溶液进行峰值检测,结果在274 nm有最大吸收峰,所以选274 nm作为检测波长。见图1。

  图1  百里香酚最大波长扫描图(略)

  Fig.1  Wavelength screen of thymol

  2.2  线性关系的考察
   
  精密称取百里香酚对照品12.30 mg,置10 mL量瓶中,加体积分数为95%的乙醇溶解并至刻度,摇匀,精密量取上述溶液5 mL,置10 mL量瓶中,加体积分数为95%的乙醇至刻度,制成每1 mL含0.615 mg的百里香酚溶液。同理,依次从上次的溶液中取5 mL,至10 mL量瓶中,加体积分数为95%的乙醇至刻度,依次制成每1 mL分别含0.3075 mg,0.1538 mg,0.0769 mg,0.0384 mg的百里香酚溶液。进样10 μL。按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积(A)为纵坐标,百里香酚的质量浓度(ρ)为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程: 百里香酚A=8.55×106ρ+7.52×102,r=0.9999;表明百里香酚在0.04~1.23 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

  2.3  精密度试验
   
  取药材按2.7项供试品溶液的制备方法制成供试品溶液1份,每次吸取10 μL,连续进样5次,测定峰面积,求得RSD为0.13%。

  2.4  重复性试验
   
  取药材制成供试品溶液5份,测定含量,求得RSD为 0.88%,说明方法重现性良好。

  2.5  稳定性试验
   
  取“2.3”项下供试品溶液,分别在0,1,2,4,6,10,12,24 h进样分析,得RSD为1.0%,结果表明在24 h内供试品溶液中百里香酚的含量稳定。

  2.6  加样回收率试验
   
  精密称取5份已知含量的本品0.5 g,每份加入百里香酚0.8 mg,按样品测定项下测定,结果平均回收率为99.02%,RSD为1.03%,见表1。

  2.7  样品测定
   
  ①对照品溶液的制备:精密称取百里香酚对照品1.0 mg,至10 mL量瓶中,加体积分数为95%的乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。②供试品溶液的制备:取本品粉末1 g,精密称定,置60 mL圆底烧瓶中,加入12倍量体积分数为95%的乙醇12 mL,回流提取3次,每次1 h,合并提取液,用0.12 g药用炭脱色,滤过,取续滤液,即得样品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,测定,即得。测定结果见表2,图2、图3。

  表1  百里香酚回收率测定结果(略)

  Tab.1  Results of recovery test

  表2  样品中百里香酚的含量测定结果(略)

  Tab.2  Content of thymol  in samples

  图2  百里香酚的HPLC色谱图(略)

  Fig.2  HPLC chromatogram of thymol

  图3  云威灵药材的HPLC色谱图(略)

  Fig.3  HPLC chromatogram of the sample

  3  讨论

  3.1  曾试用不同溶剂如甲醇和无水乙醇回流提取,不同提取方法如冷浸、超声,也试用了提取挥发油的方法。结果表明,用甲醇提取杂质峰较多,用无水乙醇提取虽然杂质峰少,但被测物的含量稍低于用体积分数为95%的乙醇提取的样品。用体积分数为95%的乙醇为溶剂,分别用冷浸24 h,超声30 min和回流1 h方法提取,结果回流提取方法含量测定结果较高,所以选用回流提取法。又用正交试验优选出最佳提取,最佳工业为提取3次,每次1 h,加入12倍量体积分数为95%的乙醇提取效果最好。也试用了提取挥发油的方法,该方法几乎没有杂质峰,但被测物的含量较低,可能由于被测物是挥发性的,在提取过程中有损失。故选用体积分数为95%的乙醇为溶剂,加入12倍量,提取3次,每次1 h,该方法杂质峰少,并且含量高。

  3.2  实验表明不同产地和来源的百里香酚含量差异较大,10批样品中百里香酚含量为0.20%~0.64%;含量的差异可能与药材的生长环境、贮存方法和贮存时间有关系。

【】
    [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:化学工业出版社,2005:175.

  [2] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海技术出版社,1986:804.

  [3] 高宣亮.中药辞海[M].北京:医药科技出版社,1996(2):1252.