伤科接骨片对家兔骨折模型肾组织转化生长因子?β1表达的影响

              作者：张继平 张奋耿 宫丽 姚晖  邱建文 林爱华 许碧莲 吴铁

【摘要】  　　【目的】观察伤科接骨片对模型家兔骨折愈合过程中肾组织转化生长因子?β1（TGF?β1）表达变化的影响。【方法】选用36只雄性新西兰家兔，均复制成单侧桡骨中上1/3标准骨折模型；随机分为模型对照组和伤科接骨片组，每组18只，每组再分3个亚组，每个亚组6只。术后第2天开始给药，于术后第11、21和35天分别处死各亚组动物，取肾脏，采用免疫组化染色，应用图像分析的方法测定肾组织TGF?β1表达含量。 【结果】第11天和第21天时伤科接骨片组肾组织TGF?β1的表达水平均较模型对照组显著提高（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.０１）；第35天时伤科接骨片组与模型对照组比较差异无显著性意义（Ｐ＞０.０５）。【结论】伤科接骨片促进骨折愈合的作用可能与其调节肾组织TGF?β1表达水平有关。

【关键词】  伤科接骨片／药 骨折／中药疗法 肾组织／病理学 疾病模型 动物 兔

　　伤科接骨片是目前广泛应用于骨伤科临床的中成药，具有活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨、补肾壮骨等功能。临床及实验研究已从组织学、组织形态学、生物力学等不同角度证实该药能够促进骨折愈合 ［1－2］。研究表明伤科接骨片可调节骨折模型家兔愈合过程中骨痂中转化生长因子?β（TGF?β1）的合成和分泌，其作用在骨折的早、中期明显［3］。TGF?β是一族具有多种功能的蛋白多肽，在骨形成和重建过程中协调间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的活动，对骨修复发挥重要作用［４］。骨是体内TGF?β最丰富的来源，TGF?β1在骨基质中的含量约占TGF?β总量的80％～90％，体内几乎所有细胞均可合成TGF?β1并表达相关受体，因此在调节骨折愈合过程中，TGF?β1发挥的作用最为重要［5］。本研究观察了伤科接骨片对模型家兔骨折愈合过程中兔肾组织中TGF?β1表达含量的影响，现报道如下。
   
　　1  材料与方法

　　1.1  动物  5～8月龄雄性新西兰家兔36只，体质量（2.0±0.5）kg［合格证号：粤监证字2006A006SYXK（粤）2003?0001，动物环境设施合格证号：SYXK（粤）2003?0001］，由广州中医药大学实验动物中心提供。

　　1.2  药物、试剂与仪器  伤科接骨片由大连美罗中药厂生产（批号：200505209）；TGF?β1免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；HPIAS?2000多媒体彩色病理图像分析系统（同济千屏影像公司生产）；941395型显微镜（Olympus Japan）。

　　1.3  骨折模型复制［6］  用30g/L戊巴比妥钠（1mL/kg）经耳缘静脉麻醉，剪毛后常规消毒铺巾，切开皮肤，分离组织，暴露桡骨，用牙科电钻在右侧桡骨中、上段1/3交界处（即旋前圆肌止点附近）横行锯断一侧骨皮质，造成3mm宽的骨缺损，保留尺骨完整。逐层缝合，包扎伤口，但不固定。骨折术后即肌肉注射青霉素（4×105U/只）,每日1次，共3d，5d后拆除皮肤缝线。

　　1.4  分组及给药  36只造模成功的骨折家兔随机分为模型对照组和伤科接骨片组，每组18只。每组再分3个亚组（分别于术后11、21、35d处死），每个亚组6只。动物单笼饲养，术后第2天开始给药，伤科接骨片组给予含伤科接骨片的饲料（按150mg·kg-1·d-1的药量将药片加入标准颗粒饲料中制成含药饲料）120g，模型对照组给予标准颗粒饲料120g，每天1次，直至处死。

　　1.5  肾组织标本留取  家兔分别于术后第11、21、35天以戊巴比妥钠麻醉后心脏放血处死，腹正中切口取肾脏去包膜，置入Bouin液中固定。

　　1.6  免疫组织化学染色  肾组织固定后，经常规酒精脱水，石蜡包埋，制成4μm切片，37℃恒温箱过夜；采用链霉亲和素-生物素复合物法（SABC法）检测TGF?β1，切片脱蜡至水，依次经体积分数0.3% H2O2室温15min，复合消化液室温10min，正常血清封闭液37℃、30min，兔抗TGF?β1多克隆抗体（1：150）4℃过夜；生物素化羊抗兔IgG 37℃、30min，SABC试剂 37℃、30min；3?3??二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精对比染色；脱水、透明、封片；用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，用试剂盒内阳性切片作阳性对照。

　　1.7  结果判断及图像分析  以肾小管间质细胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。将免疫组化切片置显微镜下（×400），对所测视野进行准确定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入病理图像分析系统进行处理，每例随机选取8个完整而不重叠的视野进行定量分析，以TGF?β1蛋白免疫组化反应阳性颗粒的染色强度（灰度值）和阳性颗粒面积与视野面积的阳性面积比率来反映肾组织TGF?β1的表达水平。

　　1.8  统计学方法  采用SPSS 11.0软件进行数据的统计分析。
   
　　2  结果

　　2.1  各组肾组织免疫组化染色比较  骨折术后第11天，相当于血肿机化演进期，伤科接骨片组呈强阳性染色，见图1-b1，而模型对照组阳性染色弱，见图1-a1；骨折术后第21天，相当于原始骨痂形成期，伤科接骨片组呈阳性染色，染色深，面积广，见图1-b2，而模型对照组阳性染色浅，面积小，见图1-a2；骨折术后第35天，相当于骨痂改造塑形期，伤科接骨片组呈弱阳性染色，见图1-b3，而模型对照组染色较浅或未见明显染色，见图1-a3。

　　a1模型对照组（第11天）        a2模型对照组（第21天）        a3模型对照组（第35天）

　　b1伤科接骨片组（第11天）        b2伤科接骨片组（第21天）        b3伤科接骨片组（第35天）

　　图1  各组肾组织转化生长因子表达比较（免疫组化，×400）（略）

　　Figure 1  Comparison of renal TGF expression in different groups detected by immunohistochemical assay

　　2.2  各组肾组织TGF?β1表达染色强度比较  表１结果显示，骨折术后第11天，伤科接骨片组呈强阳性染色，而模型对照组阳性染色弱，两组比较差异有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；骨折术后第21天，伤科接骨片组呈阳性染色，而模型对照组阳性染色浅、面积小，两组比较差异有显著性意义（Ｐ＜０.０５）；骨折术后第35天，伤科接骨片组呈弱阳性染色，而模型对照组染色较浅或未见明显染色，两组染色强度比较差异无显著性意义（Ｐ＞０.０５）。

　　2.3  各组肾组织TGF?β1表达阳性面积比率比较  表２结果显示，骨折术后第11天，伤科接骨片组肾组织TGF?β1表达阳性面积比率较模型对照组高，差异有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；骨折术后第21天，伤科接骨片组肾组织TGF?β1表达阳性面积比率也较模型对照组高，差异有显著性意义（Ｐ＜０.０５）；骨折术后第35天，伤科接骨片组肾组织TGF?β1表达阳性面积比率与模型对照组比较差异无显著性意义（Ｐ＞０.０５）。

　　表1  各组骨折模型家兔肾组织TGF?β1的表达染色强度比较（略）

　　Table 1  Comparison of renal TGF?β1 expression in the two groups

　　统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与模型对照组比较

　　表2  各组骨折模型家兔肾组织TGF?β1的表达阳性面积比率比较（略）

　　Table 2  Comparison of positive area ratio of renal TGF?β1 expression in the two groups

　　统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与模型对照组比较

　　3  讨论
   
　　伤科接骨片是骨伤科临床上行之有效的中成药，其组成包括活血化瘀药（三七、红花、乳香和没药）、动物骨类药（鸡骨、土鳖虫和海星）和富含铜类药（铜）等，能通过改善血液循环、促进血肿吸收和机化、促进成骨细胞分化与增殖、促进骨折部位胶原合成及钙盐沉积而促进骨痂矿化等，发挥其活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨、补肾壮骨的功能［7］。
   
　　研究表明TGF?β1有明显促进骨折愈合的作用［8-9］。TGF?β1从骨折初期启动，介导间充质细胞增殖、分化，然后调节软骨细胞、成骨细胞分化、增殖、蛋白质合成，到适当时机调控终末分化细胞演变，使这些细胞进入有的发育过程，发挥其骨损伤修复功能。免疫组化和原位杂交检测结果表明，骨痂中确实存在TGF?β1及其基因表达，而且在骨折修复的不同阶段，TGF?β1基因的表达情况是不同的，在骨折后第2周，TGF?β1在软骨小岛内的软骨细胞中高表达，骨折后4周左右，TGF?β1在成骨细胞内表达显著，术后6周在各种细胞内TGF?β1表达消失，8周时骨基质中TGF?β1表达又有增高趋势［10-11］。
   
　　TGF?β的含量以骨组织和血小板中最为丰富，骨组织中TGF?β的含量为0.3mg/kg，是血小板含量的1/10。骨组织中的TGF?β1在骨形成和骨重建过程中协调间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的活动，对骨折修复发挥着重要作用。本研究结果显示，骨折后第11天伤科接骨片组肾组织中TGF?β1的表达呈强阳性染色，染色深，面积广，较模型对照组阳性染色明显；第21天阳性表达亦较模型对照组明显；骨折后第35天呈弱阳性表达，与模型对照组比较无显著性差异，结果与骨折模型骨痂中TGF?β1的动态变化趋势是一致的［11］，表明伤科接骨片可以促进骨折愈合早、中期肾组织TGF?β1的表达，与其促进骨折愈合的作用主要表现在血肿机化期和骨痂形成期是相符的［12］。其确切机制有待进一步研究。

【】
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