健脾养荣片对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的保护作用

【摘要】  　　【目的】观察健脾养荣片对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响。【方法】取NIH小鼠60只随机分为6组，即健脾养荣片低、中、高剂量组（剂量分别为4、8、16g·kg-1·d-1），鲨肝醇组（剂量为0.055g·kg-1·d-1），模型组和正常组，每组各10只，分别按设计剂量灌胃给药，在第5天时用环磷酰胺200mg/kg腹腔注射复制小鼠免疫低下模型，至第9天检测各组小鼠外周血白细胞计数、碳粒廓清实验、骨髓有核细胞计数、脾指数和脾淋巴细胞增殖反应。【结果】健脾养荣片中、高剂量组和鲨肝醇组小鼠白细胞数显著高于模型组（P＜0.01）；健脾养荣片中剂量组白细胞数与鲨肝醇组比较显著升高（P＜0.05）。健脾养荣片中、高剂量组廓清指数K显著升高（P＜0.05），经校正后，其校正廓清指数a值比较，健脾养荣片中剂量组高于模型组（P＜0.01）。健脾养荣片中剂量组骨髓有核细胞数与模型组比较显著升高（P＜0.01），显著高于健脾养荣片低剂量组和鲨肝醇组（P＜0.05）。健脾养荣片中剂量组和鲨肝醇组的脾指数显著升高（P＜0.05）；健脾养荣片中、高剂量组和鲨肝醇组均能拮抗环磷酰胺对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的抑制作用（P＜0.01）。【结论】健脾养荣片能增强免疫功能低下小鼠的免疫功能，升高小鼠外周血白细胞数。

【关键词】  健脾养荣片/药 白细胞减少/中药疗法 白细胞减少/免疫学 疾病模型 动物 小鼠

　　健脾养荣片是广州中医药大学第一附属根据许鑫梅教授多年临床经验方研制而成的脾胃气血亏虚证的中成药，对白细胞减少症有良好的疗效［1］。本研究观察了健脾养荣片对免疫功能低下模型小鼠免疫功能的影响。现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物
   
　　NIH小鼠，6～8周龄，雌雄各半，体质量18～22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，粤检证字第0025458号。

　　1.2  药品
   
　　环磷酰胺注射剂由上海华联制药有限公司生产（批号：2006306），每瓶200g，用蒸馏水溶解，稀释成10mg/mL；鲨肝醇片由广东市桥制药厂（番禺）生产（批号：051209），用蒸馏水溶解，稀释成2.75mg/mL；健脾养荣片水煎剂由广州中医药大学第一附属医院购得饮片，用蒸馏水水煎浓缩，配制成浓度0.20、0.40、0.80g/mL；中华墨汁由北京一得阁制，使用时先高速离心去其下层液，再低速离心去其上清液，将中层液用生理盐水配成浓度为250g/L的墨汁；RPMI?1640培养基为Gibco公司产品；脂多糖（LPS）、T细胞丝裂源刀豆蛋白A（ConA）、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT）均为美国Sigma公司产品。

　　1.3  仪器
   
　　722分光光度计由上海仪器分析二厂生产；CX21奥林巴斯光学显微镜由日本奥林巴斯公司生产。

　　1.4  造模［2］、分组给药
   
　　NIH小鼠60只，在动物房适应饲养3d后，将小鼠随机分为6组：正常组，模型组，健脾养荣片低、中、高剂量组（剂量分别为4、8、16g·kg-1·d-1），鲨肝醇组（剂量为0.055g·kg-1·d-1），每组各10只。正常组按常规方法喂养，其他组小鼠均灌胃给予相应药液4d，于第5天腹腔注射0.2g/kg环磷酰胺1次，然后继续灌胃给药4d。

　　1.5  小鼠血白细胞计数
   
　　各组于实验第1天（给药前）、第5天、末次给药（第9天）后1h分别于眼眶静脉丛取血测定白细胞。每次取血20μL，吹入盛有0.38mL白细胞稀释液的试管中，摇匀，将盖玻片放在白细胞计数板正中，充液，静置2～3min，计数白细胞，数4角大方格的白细胞总数，×50即为白细胞数/mm3，再×106即转换成标准单位×109·L-1。

　　1.6  小鼠碳粒廓清试验［3］157
   
　　于末次给药后1h尾静脉注入250g/L中华墨汁10mL/kg，于注射后1、5min用吸管分别从眼球后静脉丛取血20μL，溶于1g/LNa2CO32mL溶液中摇匀，置分光光度计在波长675nm下比色，测定光密度（D）。将小鼠颈椎脱臼处死，称取体质量，取出小鼠肝脏、脾脏，分别称肝脾质量。按下列公式廓清指数K或校正廓清指数a：K=（LogD1-LogD2）/（t2-t1）;a=3K×mbody/（m肝+m脾）
   
　　其中，D1、D2为不同时间所取血的光密度；t2-t1为取2份血样的时间差。

　　1.7  小鼠骨髓有核细胞计数［5］253
   
　　于末次给药后1h，颈椎脱臼处死小鼠，剥离股骨，取右肢股骨，用体积分数3%的醋酸10mL冲出骨髓内细胞，在血细胞计数板上计数4个大方格的细胞数，所得数×2.5×104，即为一根股骨中的骨髓有核细胞数。

　　1.8  小鼠脾指数实验、脾淋巴细胞增殖反应
   
　　小鼠活杀后，分别取出各组小鼠的脾脏，用扭力天平称质量，所得值×100/体质量为脾指数（I脾）。取出脾脏后，无菌制成脾细胞悬液，并配制成5×106/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100μL，再分别加入完全RPMI?1640+ConA（5μg/mL）溶液或LPS（20μg/mL）溶液各100μL，置孵箱中培养72h，终止培养前4h掺入MMT，20μL/孔，培养终止时，先轻轻吸出上清，每孔再加入100μL细胞裂解液，过夜培养以充分溶解MMT，最后于酶标仪570nm处测D值。

　　1.9  统计学方法  应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。

　　2  结果

　　2.1  各组小鼠白细胞计数
   
　　表1结果显示，第1天和第5天时各组小鼠外周血白细胞数比较无显著性差异（P＞0.05）。第9天经环磷酰胺处理后，模型组白细胞计数显著低于正常组（P＜0.01）；健脾养荣片中、高剂量组和鲨肝醇组小鼠白细胞数与模型组比较显著升高（P＜0.01），而健脾养荣片低剂量组则无显著性差异（P＞0.05）；健脾养荣片中、高剂量组和鲨肝醇组白细胞计数与健脾养荣片低剂量组比较显著升高（P＜0.01）；健脾养荣片中剂量组白细胞计数显著高于鲨肝醇组（P＜0.05）。

　　2.2  各组小鼠骨髓有核细胞计数、脾指数比较
   
　　表2结果显示，模型组与正常组比较，骨髓有核细胞计数、脾指数均显著降低（P＜0.01）；健脾养荣片中剂量组与模型组比较，骨髓有核细胞计数显著升高（P＜0.01），且高于健脾养荣片低剂量组与鲨肝醇组（P＜0.05），但健脾养荣片高剂组与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）。健脾养荣片中剂量组和鲨肝醇组脾指数均高于模型组（P＜0.05），健脾养荣片低、高剂量组与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）；健脾养荣片中、高剂量组和鲨肝醇组脾指数均高于健脾养荣片低剂量组（P＜0.05）。

　　表1  各组小鼠外周血白细胞计数比较（略）

　　Table 1  Comparison of peripheral WBC count in mice of different groups

　　统计方法：方差分析；①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较；③P＜0.05，与鲨肝醇组比较；④P＜0.01，与健脾养荣片低剂量组比较

　　表2  各组小鼠脾指数、骨髓有核细胞计数比较（略）

　　Table 2  Comparison of spleen index and bone marrow nucleated cell count in different groups

　　统计方法：方差分析；①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较；④P＜0.05，与鲨肝醇组比较；⑤P＜0.05，与健脾养荣片低剂量组比较

　　2.3  各组小鼠淋巴细胞增殖反应
   
　　表3结果表明，环磷酰胺可抑制小鼠脾淋巴细胞对ConA和LPS增殖的反应，而鲨肝醇组和健脾养荣片中、高剂量均能显著拮抗环磷酰胺的抑制作用（P＜0.01），但3组间比较差异无显著性意义（P＞0.05）。

　　表3  各组对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响（略）

　　Table 3  Comparison of proliferative reaction of spleen lymphocytes in different groups

　　统计方法：方差分析；①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较；③P＜0.05，与健脾养荣片低剂量组比较

　　2.4  小鼠碳粒廓清试验
   
　　表4结果表明，健脾养荣片中、高剂量组和鲨肝醇组与模型组及健脾养荣片低剂量组比较，碳粒廓清指数K显著升高（均P＜0.05），碳粒廓清指数经校正为校正指数a值后，健脾养荣片中剂量组a值显著高于模型组（P＜0.01）。

　　表4  小鼠碳廓清指数K和校正廓清指数a值比较（略）

　　Table 4  Comparison of carbon clearance index K and corrected carbon clearance value

　　统计方法：方差分析；①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较；④P＜0.05，与健脾养荣片低剂量组比较

　　3  讨论
   
　　肿瘤的放、化疗对造血系统及免疫系统有严重的抑制不良反应，甚至可以出现因不能耐受放、化疗毒副作用而不得不终止治疗情况，有时这些毒副作用直接成为危及患者生命的主要原因［4］。近年来，运用中药配合放、化疗综合治疗肿瘤在临床上已取得明显的效果［5］，而具有增强机体免疫功能和造血功能的中药种类非常丰富，依据中医药理论组成的复方对临床常见的白细胞减少和免疫功能低下有确切的疗效［6］。中医认为，白细胞减少和免疫功能低下多属"虚劳"之气血虚范畴。为气血虚弱，不能濡养全身所致的一组证候。脾为气血生化之源，脾虚则气血生化不足，脾旺则气血充盈，故健脾可以生气血，所以说脾为后天之本。健脾养荣片即是以健脾益气方药为主组成的，主要由人参、白术、绞股蓝等组成，共奏健脾养胃、益气生血之功。有研究表明［7］，运用健脾养荣片治疗气血两虚之白细胞减少症，效果与鲨肝醇片相似。
   
　　环磷酰胺属于细胞周期非特异性化疗药物，对增殖周期中各期血细胞均有杀灭作用，但对GO期细胞的作用较弱［8］。注入小鼠腹腔后在其有杀灭细胞活力的4h内很快将骨髓中处于增殖池的各种血细胞杀灭或部分杀灭（取决于环磷酰胺的剂量），而对于处于GO期的血细胞或非增殖池（或称成熟储备池）血细胞作用较弱。小鼠注入环磷酰胺后4～96h外周血白细胞总数依靠骨髓非增殖池白细胞血液释放得以维持，由于增殖池向成熟池补充能力下降，外周血白细胞象无源之水越来越少，经4d降低至最低，到第5天时，小鼠的免疫状态就开始有所恢复［9］，故本实验选择在第5天时造模，再用药4d的给药方案，观察在免疫功能最低时小鼠的免疫能力和白细胞等情况。
   
　　器官相对质量的变化在免疫评价中占有重要地位，如研究结果与其他免疫指标所得结果（如外周血白细胞计数）相平行，则该结果更为可靠，常供药物初筛实验时用［3］722。从本实验结果来看，健脾养荣片中、高剂量组均能预防白细胞减少，加强白细胞中吞噬细胞功能，能刺激骨髓造血，促进骨髓有核细胞的增生，增强造血功能，增强小鼠脾脏指数和脾淋巴细胞的增殖反应，从而提高免疫功能低下小鼠的免疫功能。其确切机制有待进一步研究。

【】
  　　［1］罗日永，许鑫梅，邝卫红．健脾养荣片治疗白细胞减少症32例临床观察［J］．新中医，1999，31（11）：14.

　　［2］赵喜新，阎杜海，王和平，等．环磷酰胺引致的小鼠白细胞减少模型及动力学分析［J］.上海实验动物，1998，18（1）：12.

　　［3］李仪奎.中药药理实验方法学［M］．第2版.上海:上海科学技术出版社,2006.

　　［4］杨冬梅,贾敏,周玲玲,等.芪枣颗粒对小鼠免疫功能的影响［J］．中医急症,2006,15（10）：1136.

　　［5］邱凤娣．肿瘤放化疗中运用中医药的体会［J］．安徽中医学院学报，1999，18（6）：38.

　　［6］李展，曹丽，罗崇念．升血汤对环磷酰胺模型小鼠免疫和造血功能的影响［J］．中药材，2005，28（9）：812.

　　［7］杨晓军,邝卫红，熊文生．健脾养荣片治疗气血两虚型白细胞减少症120例疗效观察［J］．中国中医药科技，2004，11（1）：47.

　　［8］叶雨文,卞如濂.基础药［M］．杭州:浙江人民出版社,1979:306.

　　［9］李业鹏,计融,韩春卉,等.建立小鼠免疫低下模型的初步研究［J］．中国食品卫生杂志，2001，13（6）：7.