多囊卵巢综合征动物模型构建的研究进展与评价

【关键词】  多囊卵巢综合征 动物模型 雄激素 HCG 胰岛素抵抗

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌及代谢紊乱的疾病之一，临床主要表现为持续无排卵、高雄激素血症及高胰岛素血症或胰岛素抵抗;其病因病理机制复杂，涉及神经、内分泌、代谢系统及卵巢局部的多种调控因素。由于PCOS确切病因和病理机制尚不清楚，研究者们一直在探寻一种理想可靠的方法建立PCOS动物模型，以深入研究PCOS的发生、和，以期为临床诊断和治疗提供。大鼠有较稳定的动情周期，是目前建立模型常用的动物种类。近年来，从不同的病理角度采用不同造模方法建立了接近PCOS某些病理特征的动物模型。现将目前各种不同PCOS大鼠模型综述如下。

　　1 雄激素造模法

　　1.1 丙酸睾丸酮模型 在研究多囊卵巢综合征发病机制过程中，多毛、痤疮等高雄激素表现是PCOS的主要表现，提示高雄激素血症是该疾病的基本内分泌改变，高雄激素水平是PCOS病因的可能性，故该方法造模的基本原理在于过高的雄激素干扰了卵泡的生长成熟,而出现不排卵。

　　Beloosesky等[1]给予日龄21天的Wistar雌性大鼠丙酸睾丸酮1mg/100g体重，皮下注射，持续35天，使未成年大鼠长期处于高雄激素的刺激下，至性成熟期。实验发现，卵巢组织学改变，即各种大小不等的囊性卵泡形成，以及间质细胞增生，无新鲜黄体生成也提示无排卵出现;在内分泌方面，发现血糖/胰岛素比值显著降低，相似于人PCOS的胰岛素抵抗。国内学者周丽蓉等[2，3]采用补肾阴药治疗高雄激素、高胰岛素型的多囊卵巢综合征(PCOS)，有6O%的促排卵效果;并采用9日龄SD雌性大鼠颈背部皮下注射丙酸睾丸酮1.25mg/只(0.05ml)，70日龄起连续阴道涂片11天,观察到阴道上皮持续角化，成功诱发出不完全排卵障碍，即雄激素致不孕大鼠(ASR)模型，该大鼠成年后表现为高雄激素、高胰岛素、低促性腺激素、无排卵和多囊卵巢等。

　　本模型的特点为卵巢重量明显减轻，光镜下见卵巢被膜无增厚，皮质占主要部分，卵巢中充满大小不等的滤泡，有的囊腔较大。部分滤泡内未见卵丘、卵母细胞，偶有黄体，极少妊娠。此模型无排卵，卵巢多囊性改变与人PCOS相似外，血清激素水平也符合人PCOS。

　　1.2 脱氢表雄酮(DHEA)模型 根据大部分PCOS患者在青春期出现症状，而且在青春期前就出现血脱氢表雄(DHEA)和硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)升高的现象，推测DHEA升高可能是导致PCOS的一个主要原因。本实验机制，DHEA在卵泡膜细胞内促进睾酮的合成，使血睾酮水平升高 ，而高雄激素水平正是PCOS重要的诊断标准之一。

　　Anderson等[4，5]以DHEA皮下注射诱导SD雌性大鼠PCOS造模， 采用23日龄SD清洁雌性大鼠， 在21日龄断奶。 实验组皮下注射DHEA 6mg/100g体重/天+0.2mL注射用油剂， 连续注射20天， 建立DHEA诱导的大鼠PCOS模型。 实验表明， DHEA诱发卵巢卵泡发生闭锁及囊状扩张， 与PCOS患者卵巢病理改变相似， 但该模型与胰岛素抵抗的关系尚未清楚。 张晓薇等[6]在此基础上进行了葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素测定，即在注药第20天的晚上8时开始禁食， 次日上午8时按3g/kg的剂量灌服50%葡萄糖液， 灌糖后分别在0、30、60、120min鼠尾尖取血，测定血清胰岛素及血糖， 证明其存在着明显的高胰岛素血症。Henmi等[7]使用同样方法进行建模研究， 发现激素水平的变化接近多囊卵巢综合征患者， 包括睾酮、雄烯二酮、硫酸脱氢表雄酮、 雌二醇均显著高于对照组; 孕酮则低于对照组且有明显差异。

　　本模型特点表现为卵巢重量明显增加，且呈多囊性改变，闭锁卵泡直径显微测量明显增高，卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少，大部分未见黄体形成。激素水平的变化接近多囊卵巢综合征患者，包括睾酮、雌二醇均显著高于对照组;孕酮与对照组无显著差异。但血卵泡刺激素、黄体生成素、泌乳素与对照组比较无显著性差异。

　　综上所述，在囊性卵泡形成机制上，使用雄激素建模的学者认为，升高的睾酮、雄烯二酮及雌激素等性激素有可能是囊性卵泡形成的主要作用因素，而促性腺激素的作用则可能是次要的。朱辉等[8]认为，注射外源性雄激素虽可诱发卵巢多囊改变,但在形态、激素改变及对治疗的反应等许多方面都与人PCOS有很大差别。

　　2 雌激素造模法

　　常用的是戊酸雌二醇(EV)造模法。戊酸雌二醇是天然雌二醇的戊酸盐，具有雌激素的药理作用。该方法造模的基本原理，是根据高雌激素使垂体对下丘脑的GnRH的敏感性增加，LH水平上升，同时持续的雌激素刺激对垂体FSH有抑制作用，从而出现PCOS典型的垂体内分泌环境的病理。

　　Brawer等[9，10]采用成年未交配大鼠，体重200～220g，出现两次的4天1次的动情周期者进行造模，一次性注射戊酸雌二醇2mg/只，并分别在7、15、30、60天处死，分阶段观察。结果提示60天大鼠卵巢呈现多囊样改变，组织学方面卵巢体积减小，各级卵泡在数量上均有不同程度的减少，部分次级卵泡表现为囊性扩张，颗粒细胞层次减少，稀疏排列，卵论膜细胞和间质细胞增生明显，即囊性卵泡形成。FSH和LH水平呈现一个先降后升的趋势，但均较对照组降低，无显著性差异。Brawer指出促性腺激素水平是一个诱导PCOS的重要因素，FSH对多囊卵巢形成的直接作用不明显，但其在初级卵泡发育成次级卵泡的过程中仍是刺激因素，而高频率低幅度的LH 水平则有可能与多囊卵巢形成直接相关。这与雄激素建模者的观点存在差异。Lara等[11]在研究神经调节对多囊卵巢综合征形成的作用时同样采用了戊酸雌二醇诱导的大鼠模型，使用Sprague?Dawley(SD)大鼠取代了Wistar大鼠，取模型在给药后第30天和第60天的标本，发现有关指标与Brawer模型相同。不同的学者又对不同给药剂量进行了摸索。Stener?Victorin等[12]对SD大鼠模型的诱导剂戊酸雌二醇进行了剂量上的调整，即不同时间不同剂量的诱导剂的影响。分别一次性注射戊酸雌二醇1mg/只、2mg/只、4mg/只于不同剂量组，并分别在15、30、60天处死动物，观察卵巢形态及其他改变，结果提示4mg/只剂量组60天时卵巢呈现多囊样改变，其余各项指标与人PCOS接近。但卵巢体积随剂量和时间的递增呈减小趋势，研究者认为这可能与陈旧性黄体不断减少而无排卵无新鲜黄体生成有关。

　　综上所述，本模型卵巢和激素分泌的特点接近人PCOS，但是否有糖、脂代谢失调研究未见报道。认为可作为PCOS生殖内分泌失调为主的动物模型。

　　3 胰岛素(INS)联合HCG造模法

　　Poresky首先建立胰岛素(INS)联合HCG诱导大鼠PCOS模型。本实验机制是胰岛素能刺激卵巢卵泡膜细胞和间质细胞合成雄激素，降低血中性激素结合蛋白(SHBG)，使雄激素浓度增加;HCG为LH的类似物，能抑制卵泡颗粒细胞的有丝分裂，从而限制颗粒细胞的数量，在与胰岛素共同作用下，出现高雄激素血症及卵泡闭锁，形成多囊。成年SD大鼠每天皮下注射人重组中效胰岛素10天，自0.5U逐渐递增至6.0U，此剂量再持续给予12天。同时皮下注射HCG 1.5U，1天2次，共9天。以5%葡萄糖溶液替代日常饮水。该模型通过大鼠阴道涂片证实无排卵;组织学改变符合人PCOS;内分泌变化上通过外源性HCG和胰岛素造成大鼠体内持续存在的LH样作用和高胰岛素血症，由此诱导出高雄激素血症。

　　Bogovich等[13]为明确多囊卵巢患者体内高胰岛素和高促黄体生成素之间的关系,将85日龄大鼠,随机分为空白组、高脂饲料组、胰岛素组(6IU/天)、促性腺激素释放激素组(GnRH,50mL/天)、HCG组(1.5IU,1天2次)、胰岛素联合HCG组、胰岛素联合促性腺激素释放激素组、HCG联合促性腺激素释放激素组、HCG和胰岛素联合促性腺激素释放激素组。在给药第23天处死,结果提示使用HCG发生了单侧或双侧卵巢多囊样改变,未使用HCG未发生卵巢多囊样改变,胰岛素联合HCG和单用HCG卵巢多囊样改变的发生率分别是80%、60%。指出持续恒定的低剂量LH样作用(人绒毛膜促性腺激素HCG)可以诱导大鼠形成卵巢单侧或双侧多囊样改变。在观察高胰岛素作用机制的实验中，Bogovich等[14]进行了不同胰岛素与HCG剂量的配伍研究，发现HCG 3.0IU与胰岛素6.0IU的组合可使模型诱导成功率达到70%～80%，在低于排卵剂量(HCG 12IU)的范围内，模型诱导成功率随HCG剂量的增加而增高，当胰岛素剂量达到或高于9.0IU时成功率降低。

　　Poretsky PCOS动物模型具有无排卵，体重增加，血清LH、雄烯二酮、胰岛素水平明显增加，大体及病理组织学检查卵巢呈典型PCOS样改变等特点，这些与临床表现相似。多数学者认为，Poretsky建立 PCOS模型作为对PCOS的相关研究较为合适。高胰岛素血症或胰岛素抵抗(IR)与PCOS的发病是近年来研究的重点，胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)或高胰岛素血症(hyperinsulinemia，HI)，可以进一步产生高雄激素血症(HA) 和高促黄体生成素(HLH)，引起长期无排卵性闭经和不孕，严重影响妇女生命质量。因此，建立PCOS?IR动物模型对临床有重要意义。

　　4 孕激素联合HCG造模法

　　本方法主要基于Bogovich等[15]的研究。通过皮埋左旋18?甲基炔诺酮，可使雌二醇、孕酮、睾酮、促卵泡素、促黄体生成素均呈现低水平，导致不排卵，而HCG在卵泡早期使用可至卵泡闭锁。目前尚无LH制品，HCG的化学结构和生物作用与LH类似，故联合使用HCG以造成PCOS动物模型。选用24日龄未成年雌性SD大鼠，随机分为两组皮下埋植左旋18?甲基炔诺酮硅胶棒(3mm)，在27日龄时每天2次皮下注射HCG 1.5IU，共注射9天，至36日龄，处死。

　　本模型特点是实验组大鼠卵巢重量增加，呈多囊性改变，卵泡颗粒细胞减少而膜细胞层增加，电镜下可见膜细胞内大量脂滴，血清孕酮、睾酮明显增高，而雌二醇改变不明显，相似于临床PCOS患者特点，认为此动物模型可作为PCOS较理想动物模型。

　　5 芳香酶抑制剂造模法

　　Hasan等[16]用芳香化酶抑制剂?来曲唑(Letrozole)造模。来曲唑可引起卵巢生成类固醇激素功能紊乱，芳香酶所依赖的FSH分泌相对不足，使雄激素无法芳香化为雌激素，从而产过多的雄激素，进而引起卵泡闭锁，无排卵，形成多囊卵巢。取6周龄雌鼠(平均体重为180g)每天口服溶解在CMC(2ml/kg)的来曲唑0.1mg或0.5mg或1mg/kg。实验周期为21天，末次给来曲唑24小时后，断头处死，取躯干血，测定血清激素水平(FSH、LH、E、P、T);卵巢内注射福尔马林中性溶液，石蜡切片染色，评价其组织学意义。

　　本模型特点是卵巢早期出现小滤泡，包膜下含有很多闭锁卵泡和处于不同发育阶段的卵泡，但无成熟卵泡生成，更无排卵迹象，被膜下的卵巢囊肿发生率高，被膜肥厚，黄体化不完全，黄体数量少。

　　以上为目前国内外采用较多的各种多囊卵巢综合征动物模型建立的方法。研究者们也在尝试各种新的诱导方法，如早期研究PCOS的病理模型主要是给大鼠注射外源性雄激素，虽然可以诱发卵巢多囊改变，但在形态、激素改变及对治疗的反应等许多方面都与人PCOS有很大差别;如使用非甾体芳香化酶抑制剂诱导法，仍在垂体促性腺激素的改变上与人PCOS有差异。因此，根据上述研究结果，在PCOS大鼠模型的探讨中，通过外源性垂体LH样作用，绒毛膜促性腺激素联合胰岛素诱导法弥补了其他方法的不足，更加符合模型建造的近似性原则[17]。近年来，人们从形态学、内分泌学等方面进行了研究，对于更深层次的探寻，如细胞水平，尚处于初步涉及。因此，动物模型的鉴定指标也较为局限。随着研究的日益深入，对人及动物模型进行细胞水平的探索势必为动物模型更加完善提供更多的鉴定标准。

【】
  　　1 Beloosesky R,Gold R,Almog B,et al.Induction of polycystic ovary by testosterone in immature female rats: modulation of apoptosis and atten?uation of glucose/insulin ratio.Int J Mol Med,2004,14(2):207?215

　　2 周丽蓉，俞 瑾.补肾阴药治疗高胰岛素高雄激素无排卵症的临床观察.中西医结合杂志，1996，16(9)：515?518

　　3 王 莉，俞 瑾.中药天癸方对雄激素致不孕大鼠下丘脑前阿黑皮原mRNA的影响.中国中西医结合杂志，2001,21(7):519?521

　　4 Anderson E,Lee GY,Obrein K.Polycystic ovarian condition in the dehydroepiandrosterone treated rat model:hyperandrogenism and the resumption of meiosis are major initial events associated with cystogensis of antral follicle.Anat Rec,1997,249:44?53

　　5 Lee MT,Anderson E,Lee GY.Changes in ovarian morphology and serum hormones in the rat after treatment with dehydroepiandrosterone.Anat Rec,1991,231(2):185?192

　　6 张晓薇，邝健全，曾爱群，等.脱氢表雄酮诱导多囊卵巢综合征动物模型的研究.广州医学院学报，2000，28(3)：14?17

　　7 Henmi H，Endo T,Nagasawa K,et al.Lysyl oxidase and MMP?2 expression in dehydroe?piandrosterone?induced polycystic ovary in rats.Biol Reprod,2001,64(1):157?162

　　8 朱 辉，倪 江，姚兰春，等.大鼠多囊卵巢动物模型的实验研究.哈尔滨医科大学学报，1999,33(6):187?188

　　9 Brawer JR,Naflolin F,Martin J,et al.Effects of asingle in jection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat.Endocrinology,1978,103(2):501?512

　　10Brawer JR,Mmunoz M,Farookhi R.Development of the polycystic ovarian condition (PCO) in the estradiol valerate?treated rat.Biol Reprod,1986,35(3):647?655

　　11Lara HE,Dissen GH,Leyton V,et al.An increased intraovarian synthesis of nerve growth factor and its Low affinity receptor is a principal component of steoid?induced polycystic ovary in the rat.Endocrinology,2000,141(3):1059?1072

　　12Stener?Victorin E,Lundeberg T,Waldenstom U,et al.Effects of electro?acupuncture on nerve growth factor and ovarian morphology inrats with experimentally induced polycystic ovaries.Biology of Reproduction,2000,63(5):1497?1503

　　13Bogovich K.Induction of ovarian follicular cysts in the pregnant rat by human chorionic gonadotropin.Bio Reprod,1991,45(1):34?42

　　14Poretsky L,Clemons J,Bogovich K.Hyperinsulinemia and human chorionic gonadotropin synergistically promote the growth of ovarian follicular cysts in rats.Metabolism,1992,41(8)903?910

　　15Bogovich K.Induction of ovarian cysts in progesterone?syn?chronized immature rats:evidence that suppression of follicular aromatase activity is not a prerequisite for the induction of cystic follicles.Endocrinology,1989,124(4):1646?1653

　　16Hasan K，Mehmet I,Ilyas O,et al.Letrozole?induced polycystic ovaries in the rat:a new model for cystic ovarian disease.Medical Research,2004,35:103?108

　　17Kafali H,Irisdam M,Ozardali I,et al.Letrozole?induced polycystic ovaries in the rat:a new model for cystic ovarian disease.Arch Med Res,2004,35(2)103?108