半枝莲含药血清对肝癌H22细胞凋亡及线粒体膜电位的影响
作者：代志军, 王西京, 薛茜, 纪宗正, 刘小旭, 康华峰, 管海涛, 马小斌, 任宏涛
【摘要】 目的：探讨中药半枝莲提取物（Scutellaria Barbata extract, ESB）含药血清对肝癌H22细胞凋亡率及线粒体膜电位的影响。方法：体外培养小鼠H22肝癌细胞，以ESB高、中、低剂量含药血清培养液作用于H22细胞，并设立空白血清及5?氟尿嘧啶（fluorouracil，5?Fu）组（阳性对照组）。应用四甲基偶氮唑盐法检测药物对细胞增殖的抑制作用；透射电镜下观察肿瘤细胞的超微结构变化；碘化丙啶标记，流式细胞术检测肿瘤细胞周期及细胞凋亡情况；采用荧光探针罗丹明123负载，激光扫描共聚焦显微镜下观察H22细胞的荧光强度，分析H22细胞线粒体膜电位的大小。结果：ESB含药血清有一定的抑制H22细胞增殖的作用，高、中剂量组96 h抑制率分别为（47.5±6.4）%和（36.3±4.5）%。透射电镜下可见部分细胞呈典型凋亡形态学改变。流式细胞仪检测结果显示，ESB中、高剂量组有明显的诱导凋亡作用，其凋亡率分别为（3.15±1.12）%和（7.83±2.25）%，与空白组相比差异有统计学意义（P<0.01）。空白对照组、5?Fu组和ESB低、中、高剂量，H22细胞线粒体膜电位分别为（245.45±67.37）、（127.42±41.35）和（213.68±65.52）、（186.34±56.37）、（142.65±39.44），各组线粒体膜电位与细胞凋亡率呈负相关（r=－0.826, P<0.01）。结论：ESB含药血清可有效诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与降低肿瘤细胞线粒体膜电位有关。
【关键词】 半枝莲 肝癌 细胞凋亡 线粒体膜电位 药物血清 体外研究
Objective: To investigate the effects of serum containing Scutellaria Barbata extract (ESB) on apoptosis rate and mitochondrial transmembrane potential (MTP) of liver cancer cell line H22 from mice in vitro.
Methods: H22 cells were cultured in vitro and divided into 5 groups: blank control group, low?dose ESB group, medium?dose ESB group, high?dose ESB group and fluorouracil (5?Fu) group. Methyl thiazolyl tetrazolium assay was utilized to determine the proliferation rates of H22 cells. Cellular morphology was observed under a transmission electron microscope (EM). The rhodamine 123 was used as a fluorescence probe to label the H22 cells, and the fluorescence intensities were observed with a laser scanning confocal microscope. The fluorescence intensity of H22 cells indicated the MTP of H22 cells.
Results: The inhibition of serum containing ESB on the proliferation of H22 cells in vitro was observed in a time?dependent manner. The typical morphological changes of apoptosis were observed after incubation with ESB?containing serum in high dose for 48h. The apoptosis rates of blank control group, 5?Fu group, low?dose ESB group, medium?dose ESB group and high?dose ESB group were (0.51±0.32)%, (11.26±2.97)%, (1.07±0.46)%, (3.15±1.12)%, (7.83±2.25)% respectively. ESB could reduce the MTP of H22 cells from mice as compared with the untreated group. The MTPs of the blank control group, 5?Fu group, and low?, medium? and high?dose ESB groups were (245.45±67.37), (127.42±41.35), (213.68±65.52), (186.34±56.37) and (142.65±39.44) respectively, which were negatively correlated with the apoptosis rates.
Conclusion: ESB?containing serum effectively induces apoptosis, which may be related to the decrease of MTP in H22 cells.
Keywords: Scutellaria barbata; liver cancer; apoptosis; mitochondrial transmembrane potential; drug?containing serum; in vitro
半枝莲为唇形科黄芩属植物（Scutellaria barbata D. Don）的干燥全草，性辛、苦、寒，具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛等功效。报道，半枝莲可抑制多种肿瘤细胞生长［1?3］，而且可以诱导细胞凋亡，但其具体作用机制尚不清楚。近年来大量研究发现，线粒体与细胞凋亡进程密切相关，在药物诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导过程中，线粒体在促进凋亡信号和caspase激活之间起着不可替代的作用［4］。本实验通过观察半枝莲提取物（Scutellaria barbata extract, ESB）诱导H22小鼠肝癌细胞凋亡过程中线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential, MTP)变化，探讨其可能的作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物和瘤株 清洁级雄性SD大鼠，体质量220～250 g，由西安大学医学院实验动物中心提供(陕医动字第08?005号）。小鼠肝癌H22细胞株由陕西师范大学生命学院保存。
1.2 药品和试剂 新生牛血清和RPMI 1640培养基(Gibco, USA）；碘化丙啶（propidium iodide, PI）、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）和荧光探针罗丹明123（Sigma, USA）；ESB（为10︰1的水提物），批号为07078（西安中鑫生物科技有限公司）；5?氟尿嘧啶（5?fluorouracil injection, 5?Fu）注射液，250 mg/支，批号为070201（上海旭东海普药业有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。流式细胞仪（Becon Dickinson Facsalibur公司, USA），激光扫描共聚焦显微镜（Olympus, FluoViewTM FV300, Japan）。
1.3 药物血清制备 雄性SD大鼠20只，随机分为空白对照组和ESB低、中、高剂量组，每组5只。ESB高、中、低剂量组分别给予ESB 6、3、1.5 g/(kg·d)灌胃（称取相应质量ESB加入10 ml蒸馏水中制成混悬液），2次/d，共3 d；空白对照组给予灌服生理盐水。灌药前禁食4 h，自由取水。于末次灌胃后2 h心脏采血，室温下静置4 h，2 400 r/min离心10 min，分离血清，0.22 μm微孔滤膜无菌过滤后置－20 ℃冰箱保存备用。
1.4 细胞培养 肝癌H22细胞在含10%小牛血清、1×104 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640完全培养基中，于37 ℃和5% CO2饱和湿度孵箱培养。细胞经过消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。
1.5 MTT法检测H22细胞增殖率 选取对数生长期的H22细胞，调整细胞浓度为5×104/ml，加到96孔培养板中，每孔100 μl。将培养板放入37 ℃、5% CO2孵箱中培养。待细胞贴壁12 h后取出培养板，ESB各组分别加入相应的10%药物血清，同时设置空白对照组、5?Fu对照组和调零孔，每组设5个复孔。继续培养，分别于24、48、72和96 h后终止反应，每孔加入10 μl（5 μg/μl）MTT，孵育4 h。吸出上清液，加入200 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）。在平板摇床振荡10 min，用酶标仪检测490 nm波长处每孔的吸光度（absorbance, A），细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（inhibition ratio, IR）=（对照组A值－处理组A值）/对照组A值×100%。
1.6 透射电镜下观察H22细胞超微结构 取空白对照组、5?Fu对照组和ESB高剂量组H22细胞，药物作用48 h后，收集细胞，常规固定染色，透射电镜下观察细胞超微结构。
1.7 流式细胞仪检测H22细胞周期和凋亡率 取各组处于对数生长期的细胞，常规消化，制成单细胞悬液。加入离心管中，800 r/min离心5 min，弃掉离心管中上清；以冰PBS缓冲液漂洗2遍，沿管壁缓慢加入75%的冰乙醇固定，4 ℃过夜；测试前用PBS液洗去乙醇，离心除去上清，每管加入100 μg/ml RNA酶1 ml，置于37 ℃孵箱中30 min；然后每管中加入125 μg/ml PI 1 ml标记，低温（2～8 ℃）避光静置30 min，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。
1.8 激光扫描共聚焦显微镜检测H22细胞线粒体膜电位 将各组细胞以1×106个/ml重悬于培养基中。各吸取1 ml移入提前标记好的试管中；于每管中加入罗丹明123染液10 μl（终浓度1 μl/ml）；于37 ℃、5％ CO2培养箱中避光孵育20 min；离心后以培养基洗细胞2次；重悬细胞于培养基中，孵育60 min；吸取100 μl上述混合液滴加于载玻片上。将玻片固定于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，在荧光显微镜下初调焦平面，观察细胞状态及负载情况。以细胞内罗丹明123荧光强度（fluorescence intensity, FI）表示线粒体膜电位［5］。每组取3个样本，每个样本随机选取3个视野，取其均数进行统计学分析。
1.9 统计学方法 计量资料数据以x±s表示。应用SPSS 11.0统计软件进行方差分析的组间比较法，相关性分析采用Spearman法，检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 ESB含药血清对H22细胞增殖的影响 高、中剂量ESB有一定的抑制H22细胞增殖的作用，低剂量ESB对H22细胞抑制作用不明显。MTT实验结果显示，高、中剂量ESB含药血清对H22细胞增殖抑制率呈现明显的时效关系。高、中剂量组96 h抑制率分别为（47.5±6.4）%和（36.3±4.5）%。见图1。
2.2 ESB含药血清对H22细胞形态的影响 透射电镜下，ESB高剂量组肿瘤细胞部分核膜向外呈锐角凸起，核染色质浓缩边集并凝结成块，呈环状或新月状聚集在核膜周边，胞质中含有少量空泡，胞膜完整，并可见凋亡小体形成；5?Fu组可见胞质内散在分布的异染色质，内质网变疏松并与胞膜融合呈现空泡化，部分细胞肿胀坏死；空白对照组仅可见少量肿瘤细胞内染色质轻度边集。见图2。
图1 ESB含药血清对H22细胞增殖的抑制作用（略）
Figure 1 Growth inhibiting effects of ESB?containing serum on H22 cell proliferation
2.3 ESB含药血清对H22细胞周期比例和凋亡率的影响 实验各组含药血清作用H22细胞48 h后，在DNA直方图上均出现G1期前明显的细胞凋亡峰。其中空白对照组、5?Fu组和ESB低、中、高剂量组H22细胞凋亡率分别为（0.51±0.32）%、（11.26±2.97）%和（1.07±0.46）%、（3.15±1.12）%、（7.83±2.25）%。ESB高、中剂量组和5?Fu组凋亡率比空白组增加，差异有统计学意义（P<0.01）。不同周期细胞的比例也发生变化，表现为S期细胞减少，G1期细胞增多，与空白组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。
2.4 ESB含药血清对H22细胞线粒体膜电位的影响 空白对照组H22细胞内罗丹明123荧光强度最强，ESB低、中、高剂量组细胞内罗丹明123荧光强度逐渐减弱。见图4。以细胞内罗丹明123荧光强度表示线粒体膜电位，空白对照组、5?Fu组和ESB低、中、高剂量组H22细胞线粒体膜电位分别为（245.45±67.37），（127.42±41.35），（213.68±65.52）、（186.34±56.37）、（142.65±39.44）。ESB中、高剂量组线粒体膜电位比空白对照组下降，差异有统计学意义（P<0.05），且各组线粒体膜电位与细胞凋亡率呈负相关（r=－0.826, P<0.01）。
图2 高剂量ESB含药血清作用48 h 后H22细胞形态的变化（透射电镜，×5 000）（略）
Figure 2 Morphological change of H22 cells after 48?hour treatment by high?dose ESB?containing serum (transmission electron microscopy, ×5 000)
A: Normal H22 cells; B: Karyopyknosis and chromatic agglutination; C: Apoptotic body.
图3 ESB含药血清对H22细胞周期比例和凋亡率的影响（略）
Figure 3 Effect of ESB?containing serum on cell cycle ratios and apoptosis rates of H22 cells
A: Blank control group; B: 5?Fu group; C: Low?dose ESB group; D: Medium?dose ESB group; E: High?dose ESB group.
图4 ESB含药血清对H22细胞线粒体膜电位的影响（略）
Figure 4 Effect of ESB?containing serum on MTP of H22 cells
A: Blank control group; B: 5?Fu group; C: Low?dose ESB group; D: Medium?dose ESB group; E: High?dose ESB group.
3 讨论
半枝莲是近年来国内外抗肿瘤中药的研究热点之一。其主要成分为黄酮类化合物和二萜类化合物，亦含有生物碱、甾体和多糖等成分。据报道，半枝莲的活性物质主要为黄酮类化合物和二萜类化合物［6］。半枝莲具有良好的抗肿瘤活性，主治原发性肝癌等消化道肿瘤、肺癌及子宫颈癌等妇科肿瘤，并常与其他中药联合治疗多种肿瘤［1?3］。
目前研究认为［2, 7］半枝莲单药或复方对肝癌均有显著的抑制作用，体外研究也证实ESB可抑制肝癌细胞增殖，并诱导凋亡［3］。已有研究表明，ESB能诱导K562 细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖呈一定的浓度依赖关系，其作用机制可能与caspase?3的表达升高和活化有关［8］。高冬等［9］认为半枝莲能显著提高HeLa细胞内游离钙的浓度，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。血清药排除了通常体外实验中药物的各种杂质成分、电解质以及pH等因素对实验结果干扰的不利影响，客观地模拟了药物与机体相互作用的过程，其所获实验结果与在体实验有较好的一致性，为从细胞、亚细胞和基因水平研究中药的抗癌机制提供了一个更加、客观的新手段［10］。本研究应用血清药理学方法观察ESB对小鼠肝癌H22细胞的诱导凋亡作用。结果发现，透射电镜下可见部分细胞呈染色质凝集、边集，核碎裂、核固缩等典型凋亡形态学改变，并可见凋亡小体。流式细胞术分析结果发现ESB含药血清具有诱导H22细胞凋亡的作用，且随着药物浓度的提高，凋亡率增高，存在一定的剂量依赖关系。
线粒体是细胞内的重要细胞器，与细胞呼吸、氧的代谢、酶活性和能量供应有关，这些功能与线粒体膜的通透性和跨膜电位差有关［4］。当跨膜电位下降，线粒体产生了形态和功能的改变。线粒体荧光探针罗丹明123能确定细胞生活状态和细胞代谢状态，能特异地和活细胞线粒体结合。在各种刺激下，线粒体罗丹明123 荧光强度检测，可代表线粒体的量和线粒体功能状态。罗丹明123荧光强度的下降，说明线粒体内膜两侧电位差下降，不能提供足够的电位梯度使标记物被吸收和保留在线粒体中；电位差越小，线粒体吸收的染料越少，荧光强度就越弱［11］。实验证实：线粒体在死亡信号的诱导下，跨膜电位下降，膜通透转变孔道开放是细胞凋亡的早期特征［12］。本实验采用罗丹明123与H22活细胞内线粒体基质结合，对线粒体进行标记，并采用激光扫描共聚焦显微镜系统检测活细胞内的荧光强度，进行定量分析，以此反映细胞内线粒体膜电位的相对变化。实验结果表明，空白对照组H22细胞内罗丹明123荧光强度最强，ESB低、中、高剂量治疗组细胞内罗丹明123荧光强度逐渐减弱。提示ESB可能通过降低线粒体膜电位从而引起细胞凋亡。
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