中药黄斑颗粒对大鼠视网膜光损伤的防护作用

                      作者：宫媛媛, 宋毅, 解正高, 吴星伟

【摘要】  目的：观察中药复方制剂黄斑颗粒对大鼠视网膜光损伤的防护作用。方法：雄性SD大鼠24只，随机分为正常对照组、模型组和黄斑颗粒组，每组8只。黄斑颗粒组采用黄斑颗粒3.125 g/kg，1次/d，灌胃10 d。暗适应24 h后，采用自制光损伤箱，平均光照强度2 800 Lux，散瞳放入光损伤箱中持续光照5 h后，置于暗环境饲养，继续用药。2周后做视网膜电流图（electroretinogram, ERG），记录最大反应a、b波及振荡电位（oscillatory potentials, OPs），并留取眼球HE染色，光学显微镜测算外核层层数。结果：光照2周后，与模型组相比，黄斑颗粒组视网膜结构保存完好，正常对照组外核层平均有9～11层，黄斑颗粒组外核层平均仍有7～9层，而模型组仅有3～6层，差异有统计学意义（P<0.01）。黄斑颗粒组ERG反应振幅明显高于对照组，其中b波黄斑颗粒组为（319.38±71.96）μV，模型组为（135.16±42.30）μV；a波振幅黄斑颗粒组为（184.63±47.23）μV，模型组为（83.35±27.75）μV；OPs黄斑颗粒组为（239.38±20.19）μV，模型组为（125.44±26.23）μV。两组间差异有统计学意义（P<0.01）。a、b波潜伏期差异无统计学意义。结论：中药复方制剂黄斑颗粒对大鼠视网膜光损伤在形态和功能上有明显的防护作用。

【关键词】  黄斑颗粒; 视网膜电描记术; 光损伤; 视网膜变性; 大鼠

    Methods: A total of 24 male Sprague?Dawley (SD) rats were randomly divided into normal control group, untreated group and Huangban Granule group. Retinal light damage was induced by exposure to constant white fluorescent light for 5 hours at an illumination of 2 800 Lux. The Huangban Granule was given 10 days before light exposure until the animals were sacrificed in Huangban Granule group, and an equal volume of distilled water for the rats in untreated group. Electroretinogram (ERG) was recorded in all animals 2 weeks after light exposure and the animals were sacrificed for histopathological examination of retina. The outer nuclear layers (ONLs) on the superior and inferior retina were counted.

    Results: Fourteen days after light exposure, the ONLs on the superior retina were 3 to 6 in the untreated group and 7 to 9 in treatment group. There were 9 to 11 layers in normal group. The mean number of ONLs in the untreated group (4.68±1.64) was less than that in the treatment group (8.23±1.35) (P<0.01). B?wave amplitudes were (319.38±71.96) μV and (135.16±42.30) μV in Huangban Granule group and the untreated group respectively (P<0.01). A?wave amplitudes were (184.63±47.23) μV and (83.35±27.75) μV (P<0.01), and oscillatory potential amplitudes were (239.38±20.19) μV and (125.44±26.23) μV (P<0.01) respectively in the two group. There was no significant difference in implicit times of a?wave and b?wave among the three groups.

    Conclusion: Huangban Granule obviously protects both function and morphology of the retina from light?induced retinal damage in rats.

    Keywords: Huangban granule; electroretinography; light damage; retinal degeneration; rats

    视网膜容易受到光照的影响，光对视网膜的损伤有蓄积作用，目前已知过量的光线暴露可以诱导白化大鼠视网膜光感受器变性［1?3］，细胞凋亡是主要的表现方式［3?5］。流行病学研究也发现，过多暴露于太阳光可能与年龄相关性黄斑变性有关［6］。而对于视网膜变性类疾病的也一直是普遍关注的问题，光损伤诱导的视网膜变性动物模型与视网膜变性类疾病有相似的病理表现，因而常用于此类疾病的机制与治疗研究。

    研究发现，中药对视网膜的光损伤有一定的防护作用，如丹参、枸杞等具有对抗视网膜光化学损伤的作用［7, 8］。本实验中黄斑颗粒是自制复方中药颗粒冲剂，临床应用10多年，主要用于年龄相关性黄斑变性以及其他各类视网膜变性类疾病。本研究通过建立大鼠视网膜光损伤模型，用中药复方制剂黄斑颗粒灌胃的方法，观察它对光诱导大鼠视网膜损伤形态与功能的防护作用，为临床应用提供客观实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  雄性SD大鼠24只，清洁级，体质量190～210 g，由院上海实验动物中心提供，许可证号为SCXK（沪）2007?0005。

    1.1.2  实验药物  黄斑颗粒（沪药制字Z05050795，上海市药监局制剂认证），上海练塘中药厂生产，规格15 g/包，含生药53 g/包。主要组成(质量比例)：当归10份、川芎10份、菟丝子10份、灵芝10份、苍术10份、丹参10份、党参10份、海藻10份、肉苁蓉15份、枸杞子10份。

    1.2  实验方法

    1.2.1  分组及给药  采用随机数字方法将大鼠分为正常对照组、模型组和黄斑颗粒组，每组8只。

    黄斑颗粒的制备方法：将前述配比的各原料药加水煎煮2次，每次煎煮后过滤，合并两次煎煮后的滤液，沉淀，浓缩成浸膏，加入糊精和甜味剂（糊精与浸膏1︰1，适量甜味剂），再经过干燥、制粒、整粒，即得颗粒剂。光照前10 d开始喂药，成人常用剂量为30 g/d，体质量按照60 kg，药物剂量按照与人体质量换算［9］，大鼠与人之间换算系数为6.25，则大鼠用药量＝6.25×30 g/60 kg＝3.125 g/kg，将药物溶解于2 ml蒸馏水中，1次/d灌胃。模型组同时开始喂蒸馏水2 ml，1次/d，正常对照组不予特殊处理。

    1.2.2  模型制作方法  方法［10］，所有动物均在12 h明（光照强度300 lx，8：00～20：00）12 h暗（5 Lux，20：00～8：00）交替、温度为22～25 ℃，湿度为55%～60%的环境中饲养。在光照开始前24 h进行暗适应，光照前30 min在暗红灯下滴1%阿托品扩瞳后，放入自制的光照箱，采用白色荧光灯管，光照强度平均为（2 800±150）lx（光照度计为Kyoritsu?5202，日本共立仪器公司）。持续照射5 h（18：00～23：00），箱内温度为23～26 ℃，光照结束后放于暗环境中饲养，喂药组及模型组分别继续灌胃。

    1.2.3  双眼视网膜电流图检测  在光照后第14天行双眼视网膜电流图（electroretinogram, ERG）检测，暗适应过夜，检测前用速眠新（846合剂，军事医学科学院军事兽医研究所）麻醉，美多丽（复方托吡卡胺滴眼液，Mydrin?P）扩瞳，0.5%丁卡因角膜表面麻醉，用德国Roland视觉电生理仪进行检测，记录电极采用自制的环形不锈钢丝置于角膜中央，参考电极和地电极采用不锈钢针，分别置于两颊和尾部皮下，操作在暗红灯下（5 lx）进行。记录暗适应眼的最大反应（通频带0.2～300 Hz，标准白色闪光3.0 cd·s/m2，平均2次，间隔10 s）和振荡电位（通频带75～300 Hz，标准白色闪光3.0 cd·s/m2，叠加4次，间隔15 s）。分别测量最大反应的a波和b波的潜伏期（ms）及振幅（μV），振荡电位（oscillatory potentials, OPs）总振幅（μV）。双眼取平均值为1个个体。

    1.2.4  视网膜石蜡切片制作及染色  记录ERG后用10%水合氯醛过量处死大鼠，于角膜12：00处缝线做标记，取双眼球固定于10%中性福尔马林固定液中，24 h后过缝线与视神经做矢状切片，然后梯度浓度酒精脱水，石蜡包埋，切片（4 μm），苏木素和伊红染色，光学显微镜（德国Leica公司）下观察形态改变并拍照。拍照部位为距离视盘上方1.5～2 mm处。分别计数距离视盘上、下睫状体缘0.5～4.5 mm，每隔0.5 mm处的感光细胞核层数。

    1.3  统计学方法  所有数据以x±s表示，采用SAS 6.12统计软件包进行完全随机化设计资料的方差分析，两两比较采用SNK?t法，检验水准α=0.05。

    2  结  果

    2.1  光照后大鼠视网膜的形态学改变  正常对照组视网膜内、外核层染色清晰。光照后第14天，模型组视网膜外核层显著变薄，以视盘上方最明显，仅存３～４层稀疏感光细胞核，且内、外节排列紊乱，甚至消失。而黄斑颗粒组形态相对完好。见图1。距视盘不同点处外核层细胞层数变化，可见各点视网膜外核层数在黄斑颗粒组均多于模型组，模型组的上方视网膜外核层较其他部位明显减少。正常对照组、模型组和黄斑颗粒组平均外核层数分别为（10.23±1.83）、（4.68±1.64）和（8.23±1.35），黄斑颗粒组层数明显比模型组增多，3组之间比较差异有统计学意义（P<0.01）。见图2。

    2.2  ERG的变化  模型组大鼠视网膜光照后14 d ERG显示，振幅明显降低（P＜0.01），黄斑颗粒组虽比正常对照组有部分降低（P＜0.05），但高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。表1  大鼠光照14 d后ERG的变化

    3  讨  论

    年龄相关性黄斑病变和视网膜色素变性等变性类视网膜疾病，是严重的致盲性眼病，光感受器细胞的凋亡是其主要的表现，其过程与视网膜的光化学损伤密切相关。光照会加重视网膜变性的进程，其机制可能是活性氧、自由基造成的视网膜脂质过氧化损伤从而激发视网膜细胞的凋亡过程。环境光和人造光源的应用，如眼科光学检查及手术仪器光源，对视网膜的损伤，都是潜在的威胁。光损伤动物模型的建立使人们对这一病理现象进行了较多深入的研究，由于这一模型与人类一些视网膜变性疾病有相似的病理过程，因而对其损伤机制、药物治疗等的研究一直是眼科重要的课题［11?14］。

    正常眼介质（角膜、房水、晶状体和玻璃体）至少可以传递1%波长在400～1 400 nm的放射光线，而这部分光线对视网膜是有损害的。不同波长的光对视网膜组织的损伤机制不同，主要有机械损伤，光凝作用，光化学损伤，其中光化学损伤起着相当重要的作用［11, 12］。既往研究证实视网膜光损伤模型是一种氧化应激模型，与自由基和脂质过氧化有关，属于一种光化学损伤［11, 15］。光照射视网膜引起组织发生过氧化反应,光感受细胞的外节是体内含长链不饱和脂肪酸最高的组织，这些长链不饱和脂肪酸具有易受自由基攻击的亚甲基结构，对过氧化物极敏感，易与OH反应形成脂质自由基，并攻击其他不饱和脂肪酸引起连锁反应，使核膜、盘膜、线粒体和内质网的脂质发生过氧化，最终导致这些生物膜溶解和破坏，造成视网膜光损伤。

    视网膜感光细胞的抗氧化应激能力主要依赖于内源性抗氧化系统和视网膜色素上皮以及视网膜胶质细胞分泌的神经营养因子［16, 17］，但如果自由基生成量超过了机体清除能力时，细胞将受到损害。研究表明外源性抗氧化剂对光损伤后视网膜具有保护作用［18］。黄斑颗粒具有温阳补肾益肝、生精养血通络之功效，其中不乏抗氧化［19］以及改善微循环的单味成分，但复方制剂成分较复杂，可能是通过清除自由基抗氧化抗凋亡而发挥作用，其具体机制尚需要进一步探讨。

    本研究中我们采用自制的光损伤箱，成功建立了SD大鼠光损伤模型，稳定性较好，视网膜的损伤有明显的区域选择性，在本研究中以上方视网膜损伤最重，见图2模型组所示。在光照后第14天，光学显微镜下可见到视网膜此区域明显的外段损伤，外颗粒层数目减少，而在黄斑颗粒组则形态相对保存完好，差异有统计学意义。在图2中，能够较为形象直观地看到视网膜外核层距离视乳头不同点处的层数变化情况，在黄斑颗粒组各部位均得到较好的保留，与模型组相比，尤其在上方部位，黄斑颗粒组的外核层数未见明显丢失，说明黄斑颗粒能明显对抗大鼠视网膜光损伤，具有较明显的防护作用。

    ERG是眼科常用的评价视网膜功能的客观方法，a波及b波综合反映了视网膜外层、内层的功能状态，OPs则与视网膜内层的微循环状态密切相关。研究表明，黄斑颗粒组ERG各波的振幅明显高于模型组，说明黄斑颗粒对大鼠视网膜光损伤后视网膜内外层以及微循环功能状态有一定的防护作用。

    本研究结果表明，黄斑颗粒能有效抑制大鼠视网膜感光细胞的变性，同时在一定程度上保存视网膜的形态和功能，延缓病变的进展，为临床视网膜变性类疾病提供了动物实验依据。

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