糖心平胶囊对糖尿病大鼠心肌超微结构、血管紧张素Ⅱ及其1型受体的影响

                    作者：李敏, 倪青, 楚小燕, 王兆礼, 林兰

【摘要】  目的：探讨糖心平胶囊对糖尿病大鼠心肌病变的保护作用及机制。方法：80只大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，并随机分为模型组、格华止组、开搏通组和糖心平胶囊大、中、小剂量组，灌胃给药8周，并以10只正常大鼠作为正常对照组。分别采用放射免疫法和逆转录聚合酶链式反应法检测给药后各组大鼠心肌组织中Ang Ⅱ含量和AT1R mRNA表达水平，透射显微镜检测心肌超微结构的改变。结果：模型组、格华止组和糖心平中、小剂量组心肌组织中Ang Ⅱ含量和AT1R mRNA表达较正常对照组显著增高（P＜0.05，P＜0.01）。糖心平大剂量组和开搏通组心肌组织中Ang Ⅱ含量和AT1R mRNA表达低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。模型组心肌超微结构与正常对照组相比，心肌线粒体体积轻度增大。所有治疗组心肌超微结构较模型组有明显改善。结论：糖心平胶囊可能通过调整心肌局部肾素?血管紧张素系统的紊乱对糖尿病心肌病变产生保护作用。

【关键词】  糖心平胶囊; 糖尿病并发症; 血管紧张素Ⅱ; 血管紧张素Ⅱ1型受体; 心肌疾病; 大鼠

    Methods: The model of diabetes mellitus was induced by streptozotocin (STZ) injection in rats. And the rats with diabetes mellitus were randomly divided into untreated group, metformin group, captopril group, and low?, medium? and high?dose Tangxinping group; the other ten normal rats were used as normal controls. After eight?week treatment, all rats were sacrificed to detect angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) protein content and angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) mRNA expression in myocardial tissues by radioimmunoassay and reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) respectively. The ultrastructural change in myocardial tissues was detected by transmission electron microscopy.

    Results: The results of radioimmunoassay and RT?PCR showed that the content of Ang Ⅱ protein and the expression of AT1R mRNA in myocardial tissue of the untreated group was significantly increased and more than those in normal control (P＜0.05, P＜0.01). Only the content of Ang Ⅱ and expression of AT1R mRNA in high?dose Tangxinping group and captopril group were significantly lower than those in the untreated group (P＜0.05, P＜0.01). The transmission electron microscopy showed that volume of mitochondrion in myocardial tissue in the untreated group was bigger than that in normal control group. Also the volume of mitochondrion was improved in 5 treated groups, but had no significant difference when compared with the untreated group.

    Conclusion: Tangxinping may adjust the disorder of renin?angiotensin system to protect myocardial tissue in rats with cardiomyopathy due to diabetes.

    Keywords: Tangxinping capsule; diabetes complications; angiotensin Ⅱ; angiotensin Ⅱ type 1 receptor; cardiomyopathy; rats

    糖尿病性心脏病是危害较大的糖尿病慢性并发症之一，其中糖尿病心肌病变是糖尿病患者心力衰竭和心源性猝死发病率较高的病理基础。目前认为，参与心肌病变的影响因素较多，除糖尿病直接的糖、脂代谢紊乱的作用外，心肌局部的多种血管、神经、内分泌代谢因素也介入了病变过程。近年来，对血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ）及其受体在多种心血管疾病发病机制中的作用方面的研究较多。本研究拟通过观察糖心平胶囊（Tangxinping Capsule, TXPC）对糖尿病心肌病大鼠心肌Ang Ⅱ及其1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R) mRNA表达以及心肌超微结构的影响，探讨其对糖尿病心肌病变的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  雄性Wistar大鼠90只，8周龄，体质量180～200 g，清洁级，由医学院实验动物繁育场提供（动物许可证号为01?3003），普通饲料喂养。

    1.1.2  实验药品  糖心平胶囊，主要组成为黄芪、太子参、香加皮等，0.5 g/粒，相当于生药含量3.26 g，由中国中医科学院广安门制剂室提供；开搏通片（卡托普利片）由上海中美施贵宝制药厂生产，12.5 mg/片，批号为沪卫药准字(1995)第03300号；格华止片（盐酸二甲双胍片）由上海中美施贵宝制药厂生产，500 mg/片，批号为国药准字(2001)J?01(1)号。

    1.1.3  主要试剂与仪器  链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）购自美国Sigma公司；TRIzol试剂，购自美国Gibico公司；逆转录反应(reverse transcription, RT)试剂盒，购自美国Invitrogen公司；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)所需的酶及缓冲液系统为SYBR Green试剂，购自美国ABI公司；Ang Ⅱ放射免疫分析药盒，购自北京福瑞生物工程公司。5700型荧光定量PCR仪，美国ABI公司生产；FJ?2008G型自动γ免疫记数器，西安国营262厂生产。

    1.2  实验方法

    1.2.1  动物模型的制作  选取80只大鼠，按65 mg/kg体质量腹腔注射STZ建立糖尿病模型［1］。STZ临用前用pH 4.2、0.1 mmol/L的枸橼酸缓冲液配制成浓度为2%。依据注射后72 h尿糖为＋＋＋～＋＋＋＋，血糖＞16.7 mmol/L为模型成功标准。成模率约75%左右，有60只大鼠确定模型建立成功并纳入本实验。

    1.2.2  给药与分组  动物成模后1个月，60只大鼠按照随机数字表完全随机法分为模型组、开搏通组、格华止组和大、中、小剂量糖心平胶囊组，每组10只，并选10只正常大鼠设为正常对照组。糖心平大、中、小剂量组分别给予糖心平胶囊2、1和0.5 g/(kg·d)灌胃（按胶囊质量），分别相当于正常成人量的20倍、10倍和5倍；开搏通组大鼠予开搏通2.08 mg/(kg·d)灌胃，格华止组大鼠给予格华止0.25 g/(kg·d)灌胃，分别相当于正常成人给药量的10倍。连续给药8周。正常对照组和模型组大鼠予等量的生理盐水灌胃。糖尿病大鼠不用胰岛素治疗。

    1.2.3  取材及指标检测方法  动物给药8周末禁食12 h，称取质量后股静脉采血，断头处死动物，立刻开胸取出全心组织，取左室游离壁心肌约100 mg，4 ℃焦碳酸二乙酯水清洗后液氮速冻，放入－80 ℃冰箱保存准备心肌组织AT1R mRNA表达测定；另取左室游离壁心肌约100 mg －20 ℃冰箱保存准备检测心肌组织Ang Ⅱ含量。

    1.2.3.1  血糖检测  静脉采血，自动生化分析仪检测静脉血糖。

    1.2.3.2  心肌组织Ang Ⅱ含量测定  取左室游离壁心肌约100 mg，放入1 mmol/L醋酸1 ml预冷的EP管中，在冰浴条件下以12 000 r/min匀浆，匀浆液经考马思亮蓝法标定蛋白含量，采用放射免疫技术，以均相竞争法直接测定心肌组织Ang Ⅱ含量，用pg/mg心肌质量表示。

    1.2.3.3  心肌组织AT1R mRNA表达的测定  细胞总RNA的提取参照TRIzol Reagent说明书，每只取100 mg的心肌组织，采用1 ml TRIzol试剂裂解，然后依次加入氯仿、异丙醇提取总RNA。经紫外分光光度计测定本实验RNA样品260 nm 和280 nm处吸光度值（absorbance，A），A260/A280比值在1.7～1.9之间，经电泳每组均可见18 S和28 S明显条带。

    逆转录反应根据逆转录反应试剂盒要求标准进行。取总RNA 2 μl，以Oligo(dT)15为引物合成cDNA，反应总体积为10 μl。引物序列根据已克隆大鼠AT1R、磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH） cDNA完整序列设计，由北京赛百盛生物技术公司协助合成。AT1R上游引物5'?AAG GGC TAC CAG AGC GAT CA?3'；下游引物5'?GGT ATT GCC AGG TGC ACA AA?3'；扩增cDNA产物长度为275 bp。GAPDH上游引物5'?AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT?3'；下游引物5'?TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA?3'；扩增cDNA产物长度为309 bp。

    PCR所需的酶及缓冲液系统为SYBR Green试剂，按照下列热循环参数进行PCR，50 ℃ 5 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，均循环40次。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，照相记录特异性条带，然后应用激光扫描进行A值测定，以AT1R与GAPDH A值比值表示各标本的AT1R mRNA表达的相对量。

    1.2.3.4  心肌组织细胞超微结构观察  取左室室壁中层组织切成1 mm3小块，2%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂618包埋，LKB机切片，在透射电子显微镜下观察心肌细胞超微结构并摄像。

    1.3  统计学方法  采用SPSS 11.0统计软件包进行统计学处理，计量资料数据均以x±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD?t法，检验水准为α=0.05。

    2  结  果

    2.1  大鼠血糖  实验12周末，模型组及各组血糖较正常对照组明显升高（P＜0.01）；格华止组及糖心平大、中、小剂量组血糖均较模型组明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

    2.2  大鼠心肌组织Ang Ⅱ含量  模型组、格华止组和糖心平中、小剂量组心肌组织中Ang Ⅱ含量较正常对照组显著增高（P＜0.05，P＜0.01）。糖心平大剂量组和开搏通组心肌组织中Ang Ⅱ含量低于模型组（P＜0.05）。其余各组比较差异无统计学意义。见表1。

    2.3  大鼠心肌组织AT1R mRNA表达  RT?PCR电泳图中显示，各组电泳条带亮度不同，提示各组AT1R mRNA表达量不同。经吸光度比值分析，模型组大鼠心肌组织中AT1R mRNA表达吸光度比值为最高，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；糖心平胶囊中、小剂量组和格华止组AT1R基因表达吸光度也较正常对照组明显升高（P＜0.05）。糖心平大剂量组和开搏通组AT1R mRNA吸光度比值较模型组显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。其余各组无明显变化。见表1和图1。表1  各组治疗后血糖、心肌组织Ang Ⅱ含量和AT1R mRNA表达

    2.4  大鼠心肌超微结构  正常对照组心肌纤维结构清晰；线粒体圆形及椭圆形，嵴横行，三联管结构正常；毛细血管基底膜均匀。模型组心肌纤维结构不清，见少量脂滴；部分线粒体圆形及椭圆形，嵴横行；部分线粒体体积增大，嵴紊乱，部分嵴溶解，线粒体基质疏松；三联管扩张；毛细血管基底膜增厚。治疗组各组超微结构基本相同，心肌纤维结构清晰；部分线粒体体积稍增大，部分嵴紊乱；部分三联管轻度扩张；毛细血管基底膜与正常对照组基本相似。见图2和图3。

    3  讨  论

    糖尿病性心肌病变是糖尿病心血管并发症的一种，有资料显示，心肌病变作为一种特异性病变，可能是糖尿病患者心力衰竭和心源性猝死发病率高的病理基础［2］。中医认为本病发生是由于消渴病经久不愈，“久病必虚”、“久病必瘀”、“久病入络”，因虚致实，而形成虚实夹杂，以心气虚、心阴虚为本，心脉瘀阻为标之本虚标实证。糖心平是用于治疗糖尿病心脏病变的中药复方制剂，具有益气养阴、活血化瘀、宽胸宣痹之功效。主药黄芪甘温益气，配合太子参以达益气养阴之功；黄芪配伍活血药物则有化瘀通络、气行则血行之效；香加皮，辛、温，有行气宣痹之功。

    近年来，有关肾素血管紧张素系统（renin angiotensin system, RAS）在心血管疾病发病中的重要作用已进行了很多研究。Ang Ⅱ是RAS的主要活性肽，作为RAS的主要作用因子，可通过自分泌和旁分泌作用于心肌细胞、血管及细胞间质，导致心肌细胞肥大、血管收缩和心肌间质胶原的合成增加等一系列病理生理变化，从而影响心脏功能［3］。在高血压、心肌梗死后和充血性心力衰竭时的心室重塑中起重要作用［2, 4, 5］。Ang Ⅱ的生物学作用是通过组织细胞膜的ATR实现的，目前已知ATR分为AT1R、AT2R和AT4R 3型，AT1R又分为AT1Ra、AT1Rb两个亚型，主要分布在平滑肌、心、肾和肺等组织。其中有AT1R的细胞为Ang Ⅱ主要效应细胞，心肌细胞主要含有AT1R。在组织Ang Ⅱ含量增高时，AT1R基因表达增高，显示为升调节［6］。存在与Ang Ⅱ作用有关的心室重塑等病理改变可经应用血管紧张素转化酶抑制剂或AT1R阻滞剂的治疗减轻［7］。目前的研究显示，糖尿病时心肌局部交感神经活性增加，激活心脏RAS。有实验证实STZ诱导的糖尿病小鼠心肌存在肾素血管紧张素的激活和细胞的凋亡，转基因后该类小鼠心肌可观察到胰岛素样生长因子?1通过削弱P53的功能，减少Ang Ⅱ产生及AT1R的活性，从而减少氧化应激和心肌细胞死亡，延缓糖尿病心脏病的［8］。糖尿病诱导3 d后心肌细胞凋亡达高峰，同时Ang Ⅱ、肾素、AT1R增加，而血管紧张素转换酶和Ang Ⅱ的2类受体不变。使用AT1R拮抗剂能抑制AT1R和血管紧张素原，从而减少Ang Ⅱ的合成和细胞的死亡，因此糖尿病心肌病可看作依赖Ang Ⅱ的过程［9］。

    本实验观察了12周病程模型组和治疗组大鼠的心肌局部Ang Ⅱ含量以及AT1R mRNA表达的变化。结果显示，与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠Ang Ⅱ含量以及AT1R mRNA表达明显增高（P＜0.01）。治疗组中，中药大剂量组、开搏通组与模型组比较Ang Ⅱ含量、AT1R mRNA表达吸光度比值显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。这与以往相关报道相似［10?12］。

    综上所述，本实验提示随着糖尿病病程的发展，心肌局部存在着RAS的激活，这种激活状态不仅包括心肌组织中Ang Ⅱ含量升高，而且与Ang Ⅱ作用的受体AT1R表达上调有关。结合心肌超微结构观察结果，RAS的激活可能参与了糖尿病心肌病变的发生和发展。本实验的结果显示，中药糖心平胶囊和血管紧张素转换酶抑制剂同样可以调整心肌局部RAS的紊乱，这可能是其减轻糖尿病心肌病理改变的作用机制之一。

【】
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