补肾活血方对小鼠自身免疫性卵巢功能衰退的防治作用

                           作者：董莉, 姜琳, 孟炜, 朱南孙

【摘要】  目的：探讨补肾活血中药对小鼠自身免疫性卵巢功能早衰（premature ovarian failure, POF）的防治作用。方法：以BALB/c雌性小鼠卵巢组织制备卵巢抗原，皮下和两后脚掌多点注射免疫同种雌性小鼠建立卵巢早衰模型。分别在第1次免疫以及第3次免疫后给予补肾活血中药，灌服中药后分析阴道脱落细胞涂片，酶联免疫法检测外周血雌二醇（estradiol, E2）、卵泡刺激素（follicle?stimulating hormone, FSH）以及黄体生成素（luteinizing hormone, LH）浓度。结果：POF小鼠卵巢间质可见淋巴细胞浸润，外周血FSH和LH升高，E2下降明显（P<0.05）；而补肾活血中药能减少POF小鼠外周血FSH和LH含量，提高体内E2水平，早期预防比后期用药作用显著。结论：补肾活血中药主要通过纠正紊乱的生殖内分泌轴，恢复部分卵巢功能，对免疫性卵巢早衰具有防治作用。

【关键词】  卵巢功能早衰; 中草药制剂; 小鼠

　　Objective: To investigate the preventive effect of Bushen Huoxue Recipe (BSHXR), a compound traditional Chinese herbal medicine, on autoimmune premature ovarian failure (POF) in mice.

　　Methods: Ovarian antigen was prepared with the ovarian tissue of female BALB/c mice. A mouse model of POF was established by immunization injection of the ovarian antigen of isotype female mice on multiple subcutaneous sites and two posterior soles. The POF mice were treated with BSHXR after the first and third immunization. The levels of follicle?stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and estradiol (E2) in peripheral blood were detected by enzyme linked immunosorbent assay.

　　Results: Lymphocyte infiltration was appeared in ovarian stroma of POF mice. The levels of FSH and LH were evaluated and the E2 level was decreased significantly (P<0.05). BSHXR could reduce the increased levels of FSH and LH, increase the level of E2 and the number of growing and mature follicles. The efficacy of early treatment was better than that of late treatment.

　　Conclusion: BSHXR can recover ovarian function in POF mice mainly by regulating the indiscriminate hormone level, and BSHXR has preventive effect on autoimmune POF in mice.

　　Keywords: ovarian failure, premature; herbal preparations; mice

　　卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）是一类严重影响妇女生殖健康及身心健康的疾病。患者于40岁前出现闭经，伴烘热、汗出、烦躁等低雌激素症状，并常伴随其他内分泌自身免疫疾患，故其治疗比较困难。POF的发病率为1%～3%，占继发性闭经的10%～20%［1?3］。由于病因不明，治疗颇为棘手，尚无有效措施，尤其对于特发性或自身免疫性卵巢功能衰竭的患者而言，如何减缓卵巢功能衰退的速度以恢复卵巢功能，提高生活质量，是目前生殖内分泌临床研究的一项重要课题。
   
　　本研究用BALB/c雌性小鼠卵巢组织制备卵巢抗原，皮下和两后脚掌多点注射免疫同种雌性小鼠建立卵巢早衰模型。分别在第1次免疫以及第3次免疫后给予补肾活血中药，检测生殖内分泌及卵巢形态学改变，探讨补肾活血方（Bushen Huoxue Recipe，BSHXR）防治POF的作用机制，为临床运用中药治疗POF提供理论及实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  实验动物  SPF级BALB/c雌性小鼠200只，体质量15～20 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号为SYXK(沪)2004?2005。

　　1.1.2  药物及试剂  补肾活血方由仙灵脾15 g、巴戟天15 g、覆盆子15 g、菟丝子15 g、蛇床子10 g、石楠叶10 g、枸杞子15 g、党参15 g、黄芪20 g、当归15 g、川芎10 g等组成，由上海中医药大学岳阳制剂室采用醇提法制作成合剂（相当于含生药2.5 g/ml）。卵泡刺激素（follicle?stimulating hormone, FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone, LH）及雌二醇（estradiol, E2）小鼠ELISA试剂盒为美国R&B公司生产。弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant, CFA）和弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant, IFA）购自美国Sigma公司。

　　1.1.3  仪器  JY922Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新艺科器研究所），Sigma Diagnosis酶标仪（美国Sigma公司生产）。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  卵巢抗原制备  收集BALB/c雌性小鼠卵巢组织，称质量、洗净，于Tris?HCl缓冲液中剪碎并研磨成匀浆，低温下超声粉碎5 min，低温离心（4 000 r/ min，15 min；10 000 r/min，5 min），取上清液。调整浓度，使每0.1 ml含卵巢组织20 mg。

　　1.2.2  造模方法  ［4］制作POF模型，按每只小鼠10 mg（0.05 ml）卵巢抗原皮下多点注射免疫BALB/c雌性小鼠，建立POF模型。连续3次，每2周1次，第1次免疫加入等量CFA，第2、3次免疫加入等量IFA。

　　1.2.3  动物分组及给药  小鼠常规喂养标准颗粒饲料，采用随机数字表将80只小鼠分为正常组、模型组、预防组和治疗组，每组20只。预防组于第1次免疫后开始给药，共给药7周。治疗组于第3次免疫后开始给药，共给药3周。正常组及模型组均灌胃等量生理盐水，每周休息1 d。药物剂量按小鼠与人体表面积转换系数后，每只小鼠每天灌胃0.5 ml。所有动物在造模后7周（动物处死时）取材，正常组也于此时取材。

　　1.2.4  阴道脱落细胞检测  每天下午4时各组固定取3只小鼠阴道脱落细胞做涂片，置光学显微镜下观察其动情周期变化。

　　1.2.5  血清FSH、LH及E2检测  小鼠摘眼球采血，离心，取血清，按试剂盒说明书操作要求，采用酶联免疫测定法测定FSH、LH和E2含量。

　　1.2.6  卵巢组织形态学观察  称取卵巢质量后，福尔马林固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规HE染色，置光学显微镜下观察。

　　1.3  统计学方法  采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析q检验，即Newman?Kueuls法。

　　2  结果

　　2.1  阴道脱落细胞涂片  小鼠性周期一般为4～5 d，包括动情前期、动情期、动情后期和动情间期。在第1次免疫后，除正常组外，各组小鼠周期均不规则，表现为动情期和动情间期延长。第3次免疫后，模型组小鼠表现为动情间期延长，渐至无动情周期，动情间期有白细胞，可见上皮细胞相混杂。中药组表现为动情周期紊乱，动情间期明显延长。预防组仍有动情周期性变化，但动情期角化细胞数减少，动情周期延长8～10 d。

　　2.2  卵巢形态学变化  光镜下模型组见发育卵泡及成熟卵泡数明显减少，颗粒细胞排列紊乱，卵巢间质可见淋巴细胞浸润。中药治疗组发育卵泡数较之略多，而预防组可见到较多的生长卵泡及成熟卵泡。见图1。

　　2.3  补肾活血方对POF小鼠FSH、LH和E2含量的影响  模型组小鼠E2含量明显低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；预防组及治疗组小鼠E2含量明显高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组小鼠FSH、LH含量明显高于正常组（P<0.05）；预防组和治疗组大鼠FSH、LH含量显著低于模型组（P<0.05）。见表1。

　　图1  卵巢组织形态学特征（光学显微镜，×40）（略）

　　Figure 1  Morphology characteristics of ovarian tissue (Light microscope, ×40)

　　A: Normal group; B: Untreated group; C: Prevention group; D: BSHXR?treated group.

　　表1  各组小鼠FSH、LH和E2含量（略）

　　Table 1  Levels of FSH, LH and E2 in mice in different groups

　　*P<0. 05 , vs normal group; △P<0. 05, vs untreated group.

　　3  讨论
   
　　POF究其临床症状与“月水先闭”、“经水早断”等相类，归属于中医闭经、早发绝经、经断前后诸症及不孕症等范畴。中医辨证属于肾亏血瘀。故本研究采用补肾活血作为治疗原则，仙灵脾、巴戟天、蛇床子取其温补肾阳之效，覆盆子、菟丝子、枸杞子取其补肾填精之义，党参、黄芪、川芎、当归、石楠叶共奏健脾养血活血之功。药理研究表明，温肾阳中药有类雌激素样作用，通过调节下丘脑?垂体?卵巢轴，促进卵泡、子宫发育，使子宫、卵巢重量增加。仙灵脾、巴戟天等均有促卵泡发育，提高雌激素水平，增加子宫内膜雌、孕激素受体含量等作用。而当归、枸杞子、党参含有多糖、多种氨基酸及人体必须的多种微量元素，可增强机体免疫力。菟丝子、覆盆子等补肾中药能使不孕大鼠垂体降低过高的LH含量，提高垂体的反应性［5?7］。
   
　　本研究采用BALB/c雌性小鼠卵巢组织制备卵巢抗原，皮下和两后脚掌多点注射免疫同种雌性小鼠建立POF模型。我们分别在建模过程中（第1次免疫后）灌服中药，以及建模后（第3次免疫后）给予中药，旨在观察中药对POF小鼠的预防及治疗作用。我们发现中药治疗后，小鼠动情周期紊乱，动情间期明显延长，预防组动情周期延长，动情期角化细胞数减少，但仍有动情周期性变化。卵巢形态学显示预防组卵巢大体正常，可见到较多的生长卵泡及成熟卵泡，而中药治疗组卵巢稍有萎缩，卵巢间质可见淋巴细胞浸润。从生殖内分泌激素来看，预防组血清E2含量增高（P<0.05），但未达到正常状态，而FSH、LH则较模型组明显下降，与正常组相比差异无统计学意义。补肾活血中药通过调整下丘脑?垂体?卵巢轴的功能，使部分卵巢功能恢复，对免疫性卵巢早衰具有防治作用。补肾活血中药具有雌激素样作用，但并非单纯的雌激素代替作用，而是通过对神经?内分泌系统的功能调节，促进下丘脑?垂体?卵巢功能的恢复，其作用不是单一、独立的，而是多方面、综合的，这正是中医药治疗的优势所在［8］。

【】
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