肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究

                    作者：叶惠芬 刘朝晖 周小棉 陈惠玲 赵祝香

【摘要】  目的 研究肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药机制。方法 采用浓度梯度法(Etest)测定细菌对各种抗菌药物最低抑菌浓度，聚合酶链反应(PCR)扩增β?内酰胺酶基因，并对扩增产物进行基因测序，用十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)进行外膜蛋白(OMP)分析。用抑制试验进行主动外排机制检测。结果 4株菌株全部携带有SHV?12型和DHA?1型超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)基因，3株携带CTX?M?14型ESBLs基因；4株菌外膜蛋白分析发现，肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药株与敏感株相比，缺少分子量在32500～47500之间的一条带，从位置判断该条带可能为OMP 36000或OMP 37000的一种外膜蛋白；主动外排检测全部为阴性。结论 同时产多种β?内酰胺酶合并外膜蛋白缺失可能是导致本组肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药的原因。

【关键词】  肺炎克雷伯菌； β?内酰胺酶； 外膜蛋白

    ABSTRACT  Objective  To investigate the mechanism of Klebsiella pneumoniae resistant to imipenem. Methods  The minimal inhibitive concentrations (MIC) of the antimicrobial agents was determined by Etest. The genes coded the β?lactamase were amplified by polymerase chain reaction (PCR), and the sequences were analyzed. Outer membrane proteins (OMPs) were analyzed by sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gel electrophoresis (SDS?PAGE). Reserpine inhibition test was used to study the active efflux.  Results  All of the 4 strains of K.pneumonia produced SHV?12 and DHA?1 genotype. They also produced other β?lactamase (CTX?M?14 type, 3 isolates). Compared to imipenem?sensitive isolates by SDS?PAGE, the imipenem?resistant isolates markedly lacked the protein band of about 36.71ku which might be the outer membrane proteins of Omp 36,000 or Omp 37,000 according to the electrophoresis mobility. The active efflux test was negative.  Conclusion  Klebsiella pneumoniae produced more than one β?lactamase and the loss of outer membrane proteins may be accounted for the occurrence of imipenem resistance.

    KEY WORDS  Klebsiella pneumoniae;  β?lactamase;  Outer membrane protein

     肺炎克雷伯菌为临床感染常见病原菌之一，可引起肺炎、尿路感染、败血症、伤口感染、脑膜炎等多种疾病。随着多重耐药菌株的日渐增多，该菌引起的感染变得越来越困难［1，2］。亚胺培南是碳青霉烯类抗生素，其对革兰阴性菌产生的超广谱β?内酰胺酶及AmpC酶都很稳定，因此临床上亚胺培南一直是治疗革兰阴性菌感染的有效药物。近年来，由于亚胺培南的广泛使用，国内外均发现对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌，给治疗带来诸多困难。对亚胺培南耐药机制的研究以及如何减少其耐药株的产生，已成为当前该领域最为关注的焦点。我们对近年来在临床上分离的4株对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌进行研究，现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  菌株来源

    收集我院住院感染患者送检痰样本中分离的亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌4株，其中从呼吸科和ICU病房分离各1株，神经科1株，干部病房1株，全部按照《全国临床检验操作规程》第二版常规培养分离；菌株采用Bio?Merieux公司的VITEK2全自动鉴定系统鉴定。

    1.2  药敏试验

    采用Etest法测定最低抑菌浓度(MIC)，全部操作与结果判断均严格按照2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准进行。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和产酶型大肠埃希菌ATCC35218。

    1.3  ESBLs和AmpC酶检测

    采用酶提取物三维试验方法，按照［3］操作，以肺炎克雷伯菌ATCC700603和阴沟肠杆菌029M分别作为ESBLs和AmpC酶阳性质控菌株跟随试验。试验所用药敏纸片和琼脂均为英国Oxoid公司产品。

    1.4  细菌DNA的提取

    将平皿上过夜培养的受试菌落接种于5ml LB肉汤中，37℃振荡培养12～16h后，13000r/min离心1min收集沉淀(菌体)；采用赛百盛(SBS Genetech)的硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒提取细菌质粒。

    1.5  PCR扩增及序列分析

    β?内酰胺酶耐药基因所用引物文献报道［4，5］，包括TEM、SHV、CTX?M?1组、CTX?M?2组、CTX?M?9组、OXA、KPC、IMP、VIM、DHA和ACT?1型耐药基因，均由上海英骏生物有限公司合成；所有PCR反应体系一致，25μl的PCR反应体系中含有10～100ng DNA模板，Premix Taq DNA聚合酶12.5μl(所有PCR用的DNA酶、缓冲液、dNTP的2倍浓度的混合物，均购自大连宝生物工程有限公司)，相应引物各25pmol；PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，Gold View染液染色，用凝胶成像系统观察结果并照相。所有PCR产物纯化后，由上海英骏生物有限公司采用ABI PRISMB77测序仪进行序列分析。

    1.6  外膜蛋白(OMP)分析

    参考文献［6］方法并改进，将肺炎克雷伯菌接种于5ml LB培养液，置37℃恒温摇床孵育过夜，将菌液加入200ml LB液体培养基37℃恒温摇床继续培养5h后将培养物以4000r/min，4℃离心10min，弃上清，沉淀用50mmol/L pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，悬浮于10mmol/L Tris?HCl(pH7.4)，冰浴条件下超声破碎细菌，每次2s，间隔3s，共40个循环，将破碎菌液用4000r/min，4℃离心30min，以除去未破碎细菌，取上清液25000r/min 4℃离心30min，弃上清，沉淀即为外膜蛋白，沉淀细菌膜用缓冲液重新悬浮，并在样品中加苯甲基磺酰氨(PMSF)。外膜蛋白在电泳之前100℃加热5min，使蛋白质变性，十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)分离外膜蛋白，凝胶浓度12.0%，每点样糟加10μl样品，电压40v，当染料前沿进入分离胶以后，提高电压到100v，继续电泳，直至溴酚蓝染料到达分离胶底部，电泳后用考马斯亮蓝R250染色30min，脱色过夜。

    1.7  主动外排机制检测

    参考文献［7］方法进行，配制2种MH平板，1种加入20μg/ml的利舍平，另1种不加利舍平，以观察利舍平对肺炎克雷伯菌是否有抑制作用。上述平板均涂布含1.5×108CFU/ml的菌液，然后贴上亚胺培南Etest试条。含利舍平组MIC为不含利舍平组的1/3或更低，抑制试验阳性，提示主动外排存在。

    2  结果

    2.1  药敏结果

    体外活性试验表明，4株肺炎克雷伯菌对阿米卡星、头孢吡肟、头孢噻肟、哌拉西林/三唑巴坦、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸的MIC为256μg/ml，亚胺培南、环丙沙星MIC为32μg/ml，均为多重耐药。

    2.2  耐药机制

    4株亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌主动外排机制检测和ESBL、AmpC酶、β?内酰胺酶基因检测、外膜蛋白表达情况见表1。

    4株肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药性均较高，但在含利舍平的平板上，其MIC值没有明显下降，根据资料判断为主动外排机制阴性。SDS?PAGE进行外膜蛋白检测4株亚胺培南耐药株， 加1株亚胺培表1  4株肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制检测结果-：阴性；  +：阳性。南敏感株作对照检测，发现耐药株全部在32500～47500分子量之间缺失一条带，从位置判断可能为OMP 36000或OMP 37000的一种外膜蛋白。

    3  讨论

    肺炎克雷伯菌引起感染往往以耐药菌株为主，20世纪70年代流行耐庆大霉素的肺炎克雷伯菌，从20世纪80年代初发现产ESBLs菌株以后，产ESBLs肺炎克雷伯菌的流行日益严重，呈世界范围分布，且有不断增加的趋势。在所有β?内酰胺类抗生素中碳青霉烯类具有最广泛的抗菌活性，是医院严重感染常用药，尤其适用于产超广谱β?内酰胺酶或(和)AmpC酶的肠杆菌科细菌的严重感染，但随着碳青霉烯类抗生素在临床上使用增加，细菌也逐浙获得对此类药物的耐药性；临床上耐药多见于铜绿假单胞菌和不动杆菌属，在肠杆菌科中较少见。本研究中4株肺炎克雷伯菌体外活性试验显示，其不但对亚胺培南耐药，对所检测的全部抗生素均耐药，呈现多重耐药，应引起我们的高度重视。

    肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素的主要机制涉及产AmpC酶合并外膜蛋白的丢失、金属酶、OXA和KPC型β?内酰胺酶等诸多方面；耐药质粒可在细菌间通过接合、转化、转导等形式产生传播，造成严重的院内交叉感染和耐药菌的扩散；美国在几年前已有报道发现产ACT?1型β?内酰胺酶合并外膜蛋白丢失、产KPC型酶的肺炎克雷伯菌，并曾在局部造成暴发流行［8］，我国浙江张幸国也曾报道发现KPC?2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，须引起足够的重视。

    本研究未检出金属酶，也未检出主动外排机制。PCR检测发现4株全部携有SHV?12型及DHA型ESBLs基因，3株携有CTX?M?14型ESBLs基因。SDS?PAGE观察到与亚按培南敏感株相比，耐药株外膜蛋白在36000～37000分子量处缺失一条带，与国外报道相似［9］，考虑该4株菌对亚胺培南耐药可能与外膜蛋白缺失及合并产ESBLs或AmpC酶有关；因为外膜蛋白的缺失，可造成通透性的改变，而孔蛋白是抗生素或其它药物进入菌体发挥作用的主要通道。这4株菌来自不同科室，不同时间，因此考虑属于散发，未出现暴发流行状况。

【文献】
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［2］ 赵永新. 下呼吸道感染病原菌的分布及耐药性的分析［J］. 中国抗生素杂志，2006，31(3)：190～192.

［3］ 叶惠芬，刘平，杨银梅，等. 广州地区肠杆菌属高产AmpC酶和超广谱β内酰胺酶调查［J］. 中国抗生素杂志，2004，29(10)：601～602.

［4］ Woodford N, Tieruo P M Jr, Young K, et al. Outbreak of Klebsiella pneumoniae producing a new carbapenem?hydrolyxing class A β?lactamase, KPC?3, in a New York medical center ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2004,48(12):4793～4799.

［5］ 王继东，钱小毛，糜祖煌，等. 1株多重耐药肺炎克雷伯菌耐药基因和整合子、转座子遗传标记研究［J］. 微生物与感染，2006，1(4)：229～232.

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［7］ Ribera A, Jurado A, Ruiz J, et al. In vitro activity of clinafloxacin in comparison with other quinolones against Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates in the presence and absence of reserpine ［J］. Diagn Microb Infect Dis,2002,42(2):123～128.

［8］ Bratu S, Landman D, Haag R, et al. Rapid spread of carbapenem?resistant Klebsiella pneumoniae in New York city: a new threat to our antibiotic armamentarium ［J］. Arch Intern Med,2005,165(12):1430～1435.

［9］ Bradford P A, Urban C, Mariano N, et al. Imipenem resistance in Klebsiella pneumoniae is associated with the combination of ACT?1, a plasmid?mediated AmpC beta?lactamase, and the loss of an outer membrane protein ［J］. Antimicrob Agante Chemother,1997,41(3):563～569.