家蝇抗菌肽分子结构及抗菌谱研究

         作者：周义文 申萍 涂植光 尹一兵 陈辉 孟江萍　王小中 陈如山 卢亮 陈正庚

【摘要】  目的 研究家蝇抗菌肽的分子结构和抗菌谱，寻找广谱高效天然抗菌肽。方法 家蝇被损伤感染诱导免疫后制成组织匀浆，用蛋白质纯化技术分离纯化抗菌肽，测定抗菌活性及抗菌谱，纳升电喷雾飞行时间质谱测定氨基酸序列。结果 家蝇组织提取液经蛋白质纯化，得到一纯化的抗菌活性成份，纳升电喷雾飞行时间质谱测序，得到两个肽段的氨基酸序列：肽段1.QPNLYYNK和肽段2. PNNVYYTK。通过NCBInr蛋白质数据库检索，未发现有与之序列相匹配的蛋白质。该抗菌肽对11种临床标本分离菌株铜绿色假单胞菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、普通变形菌、异形柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、福氏痢疾杆菌、表葡菌、耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和白念珠菌的MIC分别为：3.89、2.22、4.44、6.67、3.33、6.67、5.0、6.67、4.44、4.44和13.33μmol/L。结论 本文得到的抗菌肽是一个新型抗菌肽，有广谱抗菌活性，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有一定的抑制作用。

【关键词】  家蝇抗菌肽； 抗菌谱； 分子结构； 氨基酸测序

    ABSTRACT  Objective  To investigate the broad spectrum and high effective natural Musca domestica antibacterial peptide, and study its molecular structure and antibacterial spectra.  Methods  Musca domestica was induced by injury-infection and subject to homogenate, and antibacterial peptide was separated, and the amino acid sequenced by Nano-ESI-Q-TOF2-MS/MS techniques. The antibacterial activity and spectra was examined by plate (KB) and dilution method.  Results  Musca domestica tissue homogenate was purified by protein purification system, and an antibacterial component obtained, it was hydrolyzed by trypsin, the amino acid sequence of tryptic hydrolysis fragments were 1. QPNLYYNK and 2. PNNVYYTK respectively, then queried NCBInr database, there was no any known proteins and polypeptides to match the antibacterial peptide. The 11 clinical strains (P.aeruginosa, E.coli, S.typhi, P.vulgaris, C.diversus, K.pneumoniae, E.cloacac, S.flexneri, S.epidermidis, Methecillin Resistant Staphylococcus and C.albicans) could obviously be inhi-bited by the antibacterial peptide，and MICs (μmol/L) were 3.89μmol/L, 2.22μmol/L, 4.44μmol/L, 6.67μmol/L, 3.33μmol/L, 6.67μmol/L, 5.0μmol/L, 6.67μmol/L, 4.44μmol/L, 4.44μmol/L and 13.33μmol/L respectively.  Conclusions  It is a new antibacterial peptide, has significantly broad antimicrobial activity, and display inhibition against Gram negative bacilli, positive coccus and C.albicans.

    KEY WORDS  Musca domestica antibacterial peptide;  Antibacterial spectra;  Molecular structure of antibacterial peptide;  Amino acid sequencing

    抗生素的广泛应用，耐药菌株和多重耐药菌株日益增加，临床抗感染已面临严峻挑战，寻找广谱高效的抗细菌、抗病毒药物，仍然是一个十分艰巨的任务。抗菌肽(antibacterial peptides)有非特异性地抗细菌、真菌、病毒等病原体作用，还可能具有抗肿瘤细胞的作用［1，2］，是一类具有潜力的新型药物。

    蝇生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明蝇应该对病原微生物有强大的免疫力。对家蝇资源的利用国外已投巨资作为高科技产业进行开发，我国还处在起步阶段。本研究从家蝇幼虫体内分离到了一种广谱抗菌活性肽，并测定了其抗菌谱和部分氨基酸序列，现报道如下。

    1  材料和方法

    1.1  菌株和家蝇

    (1)标准菌株  大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金葡菌ATCC25923购自卫生部临床检验中心。

    (2)临床分离菌株  铜绿假单胞菌(P.aerugi-nosa)、大肠埃希菌(E.coli)、伤寒沙门菌(S.typhi)、普通变形菌(P.vulgaris)、异形柠檬酸杆菌(C.diver-sus)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacac)、福氏痢疾杆菌(S.flexneri)、表葡菌(S.epidermidis)、耐甲氧西林金葡菌(Methecillin Resistant Staphylococcus aureus，MRSA)和白念珠菌(C.albicans)均为临床送检标本中分离菌株(重庆医科大学传染病学研究所提供)。

    (3)家蝇  为野外捕获人工多代繁殖的种群。

    1.2  主要试剂

    苯甲磺酰氟(PMSF)由上海生工AMRESCO分装，聚乙二醇为上海化学试剂总厂产品，氨苄西林药敏纸片为北京天坛生物所产品，Sephadex G50(Sigma公司)，蛋白质标记(MBI Fermentas公司)，酵母抽提物、胰蛋白胨(Oxoid公司)，两性离子缓冲剂、丙烯酰胺、双丙烯酰胺和四甲基乙二胺(AMRESCD公司)。

    1.3  主要试剂配制

    缓冲液A：0.1mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液，含尿素2.0mol/L，苯甲基磺酰氟化物0.1mmol/L，EDTA 2mmol/L；缓冲液B：0.1mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液，PMSF 0.1mmol/L，EDTA 0.02mol/L；缓冲液C：0.1mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液。

    1.4  主要器材

    XW-A108T碎冰机(广东番禺星威机械厂)，UFC 3TGCOO超滤柱，M.W＜10000(Millipore公司)，透析袋(Sigma公司)，Pharmacia LKB2152柱层析系列(瑞士BROMMA公司)，Agilent ll00 series高效液相色谱仪(美国)，Lichrospher C18色谱柱(汉邦公司)，PROTEIN PAR 300色谱柱(美国Waters公司)。

    1.5  免疫诱导［3］

    把盛有乙醚的培养皿放在蝇笼内，使蝇麻醉。然后用沾有细菌悬液(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金葡菌)的不锈钢针刺透体壁，立即放入另一笼内使其复苏。刺伤后饲养24h。

    1.6  组织液制备

    家蝇1.0g加液氮5g的比例混合，迅速用研钵研磨，加少量4℃缓冲液A，继续研磨成糊状，以1g组织加缓冲A 10ml的比例混匀，4℃下50000g离心60min，取上清液-80℃冰冻过夜，室温下融化，4℃下50000g离心60min，取上清液装入分子量截留值为1200U的透析袋内，包埋于聚乙二醇中，在4℃下透析过夜。

    1.7  抗菌肽纯化［4］

    待测样品溶液用UFC 3TGCOO超滤柱以50000g离心超滤，在Sephadex G50色谱柱加样1～2ml，用流动相溶液以1.0ml/min的流速进行洗脱，在214nm检测波长下，进行样品的部分收集。收集的样品真空冷冻浓缩，反相高效液相半制备柱进一步分离纯化，分析柱分析。根据色谱柱型号不同决定上样量和流速，半制备柱为1.0～2.0ml，流速为1.0ml/min；分析柱一般为10～100μl，流速为0.5ml/min；检测波长为214nm。将收集样品真空冷冻干燥，浓缩后加双蒸水溶解，使体积为原体积的1/10，用Lowry法进行蛋白定量。

    1.8  稀释法抗菌试验［2，3］

    试验菌接种到MH肉汤内，置振荡培养箱，37℃孵育12～18h，使处于对数生长期，用无菌生理盐水稀释至相当于1.5×10-5CFU/ml，加入到MH肉汤稀释的纯化抗菌肽溶液中，使其终浓度分别为20、30、40、50、60和120μg/ml(相当于2.22、3.33、4.44、5.56、6.67和13.33μmol/L)，氨苄西林作对照。以无肉眼可见细菌生长的最低抗菌肽浓度，MIC管转种MH平板，应无细菌生长或有个别细菌生长。

    1.9  氨基酸测序［5］

    抗菌肽的PAGE胶块脱色后置于真空干燥器中干燥20min，然后加入5～10mg/L的胰蛋白酶液，4℃冰箱中放置40min后，加10μl 25mmol/L碳酸氢铵缓冲液，于37℃温育过夜。用5% TFA于40℃提取酶切肽段；再用同体积的ACN-TFA溶液于30℃提取；最后用ACN超声提取一次；合并3次提取液，真空干燥器干燥。干燥后的样品用TFA溶液溶解。用配备有毛细管液相色谱和纳升喷雾源的纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(Nano-ESI-Q-TOF2-MS/MS)技术测定肽段的质谱图，确定抗菌肽氨基酸序列。

    1.10  检索数据库

    所测定得的质谱图用Micromass的专用软件MasSeq直接推导出肽段序列，根据肽段的氨基酸序列用Spectrum List通过Mascot查询NCBI数据库，确立其一级结构。

    2  结果

    2.1  家蝇抗菌肽抗菌谱鉴定结果

    用纸片琼脂扩散法即KB法(Kirby-Bauer method)检测有抗菌活性的成分，再用微量稀释法(microdilution test)测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。

    实验结果显示，分离到的家蝇抗菌肽分子量约9.0kU，具有明显的广谱抗菌活性，对革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌和真菌均有抑制作用。该抗菌肽对11种临床分离菌株的MIC在2.22～13.33μmol/L(20～120μg/ml)之间。家蝇抗菌肽对大肠埃希菌的抗菌活性相对较强，而对阳性球菌和其他肠杆菌的抗菌活性相对较弱，对白念珠菌的抗菌活性最弱。

    在对照组，氨苄西林对10种临床分离菌株的MIC在21.54～>86.16μmol/L(8～>32μg/ml)之间。临床分离菌株伤寒沙门菌、福氏痢疾杆菌敏感，大肠埃希菌、异形柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌中敏，铜绿假单胞菌、普通变形菌、肺炎克雷伯菌、表葡菌和耐甲氧西林金葡菌(MRSA)耐药。试验组和对照组对临床分离菌株的MIC见表1。

    2.2  氨基酸测序

    抗菌肽被胰蛋白酶水解后得到5个随机酶解片段，随机酶解片段用Nano-ESI-MS/MS技术进行质谱分析，测定出的质谱信息借助Micromass的专用软    表1    家蝇抗菌肽对临床分离菌株的MIC用Spectrum List通过Mascot查询NCBInr数据库，经检索未发现有与之序列相匹配的蛋白质，可以证明本研究分离纯化到的家蝇抗菌肽是一个新的抗菌肽，命名为家蝇抗菌肽Ⅰ(Musca domestica antibacterial peptide Ⅰ，MDAPⅠ)。

    3  讨论

    由于抗生素的大量应用和滥用，临床耐药菌株和多重耐药菌株的产生不断增加，抗感染形势十分严峻。特别是近年来新型病原体的不断出现和暴发流行，寻找广谱高效抗细菌、抗病毒药物仍然刻不容缓。

    近年来生物抗菌肽的发现为抗感染药物的开发开辟了一个新途径。天然抗菌肽是生物体免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。研究发现抗菌肽具有非特异性抗细菌、抗真菌的能力［6，7］，特别是对多重耐药菌有抑制作用，有望成为治疗耐药性细菌的新型药物或前体药物。

    蝇具有较强抗感染能力［8～10］，家蝇抗菌肽的研究则少有报道。本文对家蝇的研究，经过一系列的蛋白分离质纯化技术得到了纯化的具有较强抗菌活性的蝇家抗菌肽MdAPⅠ。该抗菌活性肽与报道通过RT-

    图1    家蝇抗菌肽胰蛋白酶水解的肽段1的质谱图

    PCR克隆并表达的抗大肠埃希菌活性的天蚕素分子结构完全不同［11］，用Spectrum List通过Mascot查询NCBI数据库，经检索未发现有与之序列相匹配的蛋白质，可以证明本研究分离纯化得到的家蝇抗菌肽是一个新的抗菌肽。该抗菌肽的发现为寻找高效广谱的抗菌物质提供了一个新途径。

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