生物被膜大肠埃希菌AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶的检测

【摘要】  目的 探讨大肠埃希菌生物被膜(biofilm，BF)的耐药情况，为临床合理应用抗生素提供理论依据。 方法 应用改进的平板培养法建立大肠埃希菌BF模型，用银染法和扫描电镜观察鉴定。采用改良三维试验法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶。结果 浮游大肠埃希菌(A组)单产AmpC，单产ESBLs酶及同时产ESBLs和AmpC酶的菌株分别为5.0%(2/40)、30.0%(12/40)和12.5%(5/40)；BF大肠埃希菌(B组)单产AmpC酶，单产ESBLs及同时产ESBLs和AmpC酶的菌株分别为10.0%(4/40)、45.0%(18/40)和22.5%(9/40)。对A组和B组的检出率两两分别进行χ2检验，结果均为P<0.05。产酶有BF大肠埃希菌对10种抗生素(除亚胺培南全部敏感外)的耐药率均较高。结论 BF的形成和产生ESBLs及AmpC酶的协同作用是大肠埃希菌耐药的主要原因之一。

【关键词】  大肠埃希菌； 生物被膜； 超广谱β-内酰胺酶； AmpC酶

    ABSTRACT  Objective  To evaluate the resistance mechanism of Escherichia coli growing in biofilm, and to provide the theoretical guide to select antimicrobial agents in clinic.  Methods  Model of Escherichia coli bacterial biofilm was built up by the modified flat-board method and identified by the method staining with AgNO3 and confocal scanning laser microscopy. ESBLs and AmpC β-lactamase were detected by improved three-dimension test.  Results  The detection rates of AmpC, ESBLs and ESBLs plus AmpC β-lactamase Escherichia coli were 5.0% (2/40), 30.0% (12/40) and 12.5% (5/40), whereas those in biofilm Escherichia coli were 10.0% (4/40), 45.0% (18/40) and 22.5% (9/40) respectively. the resistant rate of the biofilm Escherichia coli producing AmpC and ESBLs to 10 kinds of antibiotics was higher (except imipenem).  Conclusion  One of the main reasons that Escherichia coli was resistant to antibiotics was the synergetic effect of ESBLs, AmpC and biofilm.

    KEY WORDS  Escherichia coli;  Biofilm;  ESBLs;  AmpC enzyme

    大肠埃希菌是各类感染常见的致病菌，易于固着在生物材料的表面生长，并形成生物被膜(biofilm，BF)。常规剂量的抗生素无效，常常导致感染迁延不愈和反复急性发作。关于BF菌的耐药机制引起国内外学者的广泛关注，研究表明，大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素耐药主要是由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)和持续高水平表达的AmpC酶引起的。细菌形成BF后，其产β-内酰胺酶的活性明显增加［1，2］。本实验通过建立大肠埃希菌BF模型，检测BF内AmpC酶及ESBLs的产生情况，并进一步探讨其耐药机制，供临床选择抗生素。1  材料和方法

    1.1  材料

    大肠埃希菌40株(本院细菌室分离并鉴定)，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、阴沟肠杆菌029及029M。所有菌株均经VITEX自动化微生物分析仪鉴定。培养基胰酶大豆肉汤(TSB)为法国BioMerieux公司产品。主要仪器与药品有医用硅胶膜(1.5mm，北京医用硅胶膜研究所)、24孔板(天津有机玻璃制品厂)、扫描电镜(S-800日本HITACHI公司)、超声清洗器(GX-250，北京医疗设备二厂)、低温超速离心机(上海安亭公司)和LKB2117等电聚焦系统(LKB公司)。

    1.2  方法

    (1)BF模型的建立  采用改进的平板培养法，在硅胶膜上建立大肠埃希菌的BF模型，并用银染法和扫描电镜观察鉴定［2］。

    (2)分组  大肠埃希菌40株，经37℃ 24h孵育，比浊法配制1.5×108CFU/ml菌悬液，等分为A组(浮游细菌组)和B组(BF组)。

    (3)粗酶提取物的制备［1］  将A组及B组大肠埃希菌在37℃下孵育16h。B组细菌经孵育后将硅胶膜从培养基中移除，用生理盐水清洗2次，每次15min，除去浮游菌，用150W超声水浴震荡10min脱膜；B组脱膜后和A组细菌在4℃、6000g离心30min，弃去上清液，以0.05mol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤2次，将收获的菌体悬浮在同样适量的缓冲液中，用冻融法［1］使细菌菌体破坏，然后以低温超速20000g离心60min，上清液即为粗酶提取液。

    (4)AmpC酶鉴定实验  采用改良三维试验法［3］，取1.5×108CFU/ml标准菌株菌液均匀涂布于MH琼脂平皿，置入抗生素纸片。用无菌刀片在离纸片边缘5mm处由内向外切一条细沟长约15mm、宽约1mm，将30μl粗酶提取物由里向外加入沟槽内，避免粗酶提取物溢出沟槽，置MH琼脂平皿36℃过夜，若观察到狭缝与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域，视为三维试验阳性。氯唑西林单独加入抑酶试验阳性即AmpC酶阳性，克拉维酸单独加入抑酶试验阳性即ESBLs阳性，同时加入氯唑西林和克拉维酸抑酶试验阳性即AmpC酶和ESBLs阳性。用阴沟肠杆菌029M作为持续高产AmpC酶阳性对照，阴沟肠杆菌029和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为阴性对照。肺炎克雷伯菌ATCC700603作为ESBLs阳性对照，阴沟肠杆菌029M作为阴性对照。

    (5)药敏试验  采用KB法对B组(BF组)细菌进行药敏试验，操作及判断标准采用美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)2001。

    (6)统计方法  采用χ2检验，以P<0.05作为有显著性差异的判定标准。

    2  结果

    2.1  BF模型的建立

    大肠埃希菌在硅胶膜培养至72h的扫描电镜照片，可见细菌被浓密的纤维样的粘液物质包绕，菌体之间借纤维粘液丝相连。经银染法和扫描电镜观察证明其为BF(照片略)。

    2.2  AmpC酶和ESBLs的检出率

    BF大肠埃希菌单产AmpC酶、单产ESBLs及同时产AmpC酶和ESBLs菌株的检出率明显高于其相应的普通浮游细菌产酶菌株(P<0.05，表1)。

    2.3  B组(BF组)的药敏实验

    非产酶BF大肠埃希菌对头孢噻肟、头孢他啶及头孢曲松有较高的耐药性，对含酶抑制剂的抗生素相对较敏感。产ESBLs的BF大肠埃希菌除对β-内酰胺类抗生素耐药外，对氨基糖苷类及喹诺酮耐药率也高于非产ESBLs细菌，对头孢哌酮/舒巴坦，哌拉西林/三唑巴坦耐药率相对较低，对亚胺培南几乎全部敏感。产AmpC酶的BF大肠埃希菌对头孢吡肟耐药率较低，对亚胺培南亦敏感。产两种酶(AmpC酶及ESBLs)的BF大肠埃希菌对除亚胺培南外的9种监测抗生素的耐药率均较高(表2)。 表1  AmpC酶和ESBLs的检出结果(菌株/耐药率，%)（略 ） 表2    ESBLs、AmpC酶与非产酶细菌对10种抗生素（略 ）

    3  讨论

    BF相关感染主要包括生物医学材料相关感染和某些慢性难治性感染，由于技术的，植入和介入性操作逐渐增多，近年来，BF菌相关感染明显增多［4］。大肠埃希菌是容易形成BF的常见致病菌之一。BF菌有着特殊的结构和性质，BF深层细菌不易被抗生素完全杀灭，一旦停用抗生素耐药菌即重新形成BF，导致感染迁延不愈［5］。

    ESBLs和AmpC酶是大肠埃希菌常见的β-内酰胺酶。ESBLs由质粒介导，可通过接合、转化和传导等方式在细菌种属之间进行传递，导致耐药现象的扩散，引起严重的感染。AmpC酶是指由革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶组成的一个酶家簇。其优先选择的底物为头孢菌素类，引起革兰阴性杆菌对第三代头孢菌素和单环类化合物耐药。近年来，编码AmpC酶的基因已转移到质粒上，并在大肠埃希菌中持续高水平表达。国内外的研究表明，BF菌比普通浮游菌容易产生β-内酰胺酶［1，2］。本实验结果表明BF大肠埃希菌产酶菌株(单产AmpC酶、ESBLs及同时产AmpC酶和ESBLs)的检出率明显高于其相应的普通浮游细菌产酶菌株(P<0.05)，其原因可能由于BF菌有其特殊的结构特点和生理特性，使其生长缓慢、代谢减低、对外界刺激不敏感，对抗生素的通透性减弱，尤其是被膜深层的细菌很难被抗生素杀灭。低于致死剂量的抗生素反而有利于细菌开启抗生素水解酶如β-内酰胺酶的表达［1，2，6］。

    本实验结果表明，非产酶BF大肠埃希菌对三代头孢菌素有较高的耐药性，对含酶抑制剂的抗生素相对较敏感。亚胺培南的抗菌活性最高，无耐药菌株。产ESBLs的BF大肠埃希菌除对β-内酰胺类抗生素耐药外，对氨基糖苷类及喹诺酮类耐药率也高于非产ESBLs细菌，对加酶抑制剂的复合制剂如头孢哌酮/舒巴坦，哌拉西林/三唑巴坦耐药率相对较低，对亚胺培南几乎都敏感。产AmpC酶的BF大肠埃希菌对第四代头孢菌素耐药率较低，对亚胺培南亦敏感。对β-内酰胺类抗生素及加酶抑制剂的抗生素耐药率较高。产酶BF大肠埃希菌(AmpC酶及ESBLs)对10种监测抗生素(除亚胺培南全部敏感外)的耐药率均较高，提示大肠埃希菌对头孢菌素类抗生素耐药的主要原因是在有BF形成的情况下，促进了AmpC酶和ESBLs的产生，而这两种酶同时存在又增加了耐药的复杂性。

    综上，ESBLs、AmpC酶和BF的协同作用使大肠埃希菌的耐药性增强，所以大肠埃希菌引起的相关难治性感染时要及时检测ESBLs、AmpC酶和BF的形成。耐药性是抗生素应用的直接后果，所以临床上应用抗生素，特别是广谱抗生素时应严格掌握指征，以减轻抗生素的选择性压力。合理应用抗生素，加强本地区细菌耐药监测，适时地联用β-内酰胺酶的抑制剂及其复合制剂。

【】
  ［1］ Strathmann M, Wingender J, Flemming H C. Application of fluorescently labbelled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa ［J］. J Microbiol Methods,2002,50(3):237～248.

［2］ 何平，李乃静，李胜岐. 生物被膜大肠杆菌β-内酰胺酶活性的检测［J］. 中华结核和呼吸杂志，2001，24(9)：537～538.

［3］ 于方友. 质粒介导的酶研究进展［J］. 中华检验医学杂志，2003，26：706～709.

［4］ Pal Z, Urban E, Dosa E, et al. Biofilm formation on intrauterine devices in relation to duration of use ［J］. J Med Microbiol,2005,54(12):1199～1203.

［5］ Spoering A L, Lewis K. Biofilms and plankonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials ［J］. J Bacteriol,2001,183(23):6746～6751.

［6］ 李胜岐，谷秀，李乃静，等. 检测生物被膜铜绿假单胞菌、克雷伯菌产β-内酰胺酶活性［J］. 中华医院感染学杂志，2002，12(9)：649～651.