链霉菌自动调控因子的研究进展

【摘要】  γ-丁酸内酯自动调控因子是一种由链霉菌产生的被称为微生物“激素”的小分子化合物，它控制着链霉菌次级代谢物的产生或形态分化。根据该类自动调控因子C-2位细微的结构差别分为三种类型，分别为A因子型、VB型和IM-2型。本文详细介绍了每种类型中具有代表性的自动调控因子、受体及其对链霉菌次级代谢与形态分化的调控作用，并系统地阐述了其调控。

【关键词】  链霉菌； 自动调控因子； 受体； 调控网络

    ABSTRACT  γ-Butyrolactone autoregulator produced in Streptomyces is a low-molecular-weight compound controlling secondary metabolism and morphological differentiation in Streptomyces. Based on minor structural difference in the C-2 side chain, these autoregulators chemically identified to date can be classified into three types: the A-factor type, the virginiae butanolide (VB) type and the IM-2 type. In this review, a detailed description was given on characterization of the representative autoregulators in each type and their receptors to secondary metabolism and morphological differentiation in Streptomyces. The regulatory networks were also illustrated systematically.

    KEY WORDS  Streptomyces;  Autoregulators;  Receptor;  Regulatory network

     链霉菌(Streptomyces)中有一类自动调控因子(Autoregulator)，作为胞外信号分子控制着链霉菌次级代谢物的产生或其形态分化，被称为微生物“激素”，有着特殊2，3-二替代-γ-丁酸内酯框架，因此被称作γ-丁酸内酯自动调控因子［1］。迄今已经在7类链霉菌中鉴定了14种γ-丁酸内酯［2］，根据C-2位结构的细微差别可分为三种类型(表1)：①A因子型，含6-酮基；②VB型(Virginae butanolides，VBs)，含6-α羟基，以弗吉尼亚链霉菌(S.virginiae)中VB-A～E为代表；③IM-2型，含6-β羟基，以浅紫灰链霉菌(S.lavendu-lae)IM-2和天蓝色链霉菌(S.coelicolor)中SCBs(SCB1～3)为代表，化学结构见图1。现分别叙述上述三种类型中具有代表性的γ-丁酸内酯及其对次级代谢与形态分化的调控作用。表1        链霉菌中γ-丁酸内酯自动调控因子的类型、组成与来源菌株

    1  A因子型

    1967年，Khokhlov等［3］发现一种能使“光秃”的灰色链霉菌突变株恢复气生菌丝形成能力的小分子，这种小分子就是A因子。之后，Hara等［4］发现A因子对链霉素的生物合成也是必需的。A因子浓度低至10-9mol/L即可恢复其缺陷型突变株的链霉素产生和孢子形成能力。AfsA是A因子生物合成的关键酶，A因子由一种甘油衍生物和一种β-酮酸衍生物缩合而成［5］，最近研究发现其生物合成的具体过程如下［6］：在AfsA作用下，将8-甲基-3-壬酮酰-ACP的酮酰基转移到磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)产生了8-甲基-3壬酮酰-DHAP酯，随后依次通过分子间的羟醛缩合、位于afsA下游的基因编码产物BprA的还原作用和磷酸酶的去磷酸化作用，最终合成了A因子。

    A因子受体ArpA以二聚体形式和A因子结合，其氨基端有一个螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)结构域，该结构域可能是DNA的结合位点［7］。Onaka等［8］发现，当ArpA的Pro115被Ser替代时就失去了结合DNA的能力，但仍具有结合配体A因子的能力，表明ArpA有两个独立的功能区域，一个位于羧基端与A因子结合，另一个位于氨基端与DNA结合的HTH结构域。此外，定点突变试验发现ArpA的Val41和Trp119分别是DNA结合和A因子结合所必需的［9］。A因子突变株相对于野生株提前产生链霉素，且产量提高了10倍，而将arpA基因高拷贝转入其中，结果该突变株完全丧失了链霉素产生和形态分化能力，这说明ArpA对链霉素产生和形态分化起着阻遏作用。

    Ohnishi等［10］分离纯化AdpA(A-factor-dependent-protein)，其激活参与形态分化与次级代谢的多种基因。只有当A因子存在时，adpA才能转录，而且adpA的启动子区域为ArpA的结合位点，这是迄今发现的ArpA唯一的靶基因［11］。通过凝胶移位以及PCR处理得到可与AdpA特异性结合的多个DNA片段［12］，已其中的几个片段进行了功能研究［13～15］(图2)。

    综合上述研究，A因子参与形态分化及次级代谢的调控网络如下(图2)：在菌体生长初期，A因子浓度很低， ArpA结合adpA启动子区域抑制其转录； 随着菌体的生长，A因子不断积累，当浓度达到阈值时，A因子结合ArpA并从adpA启动子解离下来，诱发AdpA的转录；AdpA控制着一系列参与形态分化和次级代谢基因的转录，形成一个AdpA控制的调控网络。

    图2    A因子对形态分化和次级代谢的调控网络［13］

    2  VB型

    Yanagimoto等研究发现弗吉尼亚链霉菌中存在一种因子能诱导产生维吉霉素M1和S两种抗生素(virginiamycin M1 and S，VM1和VS)［16］。直到1987年，Yamada等［17］才从该菌中分离出三种结构上非常相似并能诱导菌体产生维吉霉素的小分子化合物，分别命名为VB-A、VB-B和VB-C。随后，Kondo等［18］又发现了两种新的VBs，分别命名为VB-D和VB-E，在天然的VBs中，VB-A的活性最高。VBs的生物合成第一步与A因子类似，不同的是随后依次经过磷酸酶的去磷酸化作用、分子间的羟醛缩合和还原酶的作用产生VBs［6］。

    VBs的受体BarA氨基端也有一种HTH结构域，BarA作为转录抑制因子控制自身的编码基因barA的转录，形成了自我调节环路［19］。Nakano等［20］构建的NH1突变株破坏了BarA HTH结构域，NH2突变株破坏了BarA羧基端，但保留HTH结构域，两突变株都比野生株提前产生维吉霉素，只有NH2突变株与野生株产生VBs。这表明BarA是一种双功能的调控蛋白，既抑制维吉霉素的产生又能激活VBs的合成，并且HTH结构域对VBs的生物合成至关重要。

    Kinoshita等［19］发现临近barA存在着两个基因：一个在下游为barB，BarB可间接控制维吉霉素的产生［21］；另一个在上游为barX，BarX与AfsA具有较高的同源性，但它并不是VBs合成的酶，而是作为多效调控蛋白间接控制着维吉霉素的产生、VBs合成和VM1抗性的产生，另外还发现BarX与BarA通过蛋白与蛋白之间的相互作用，加强BarA的DNA结合能力［22］。迄今为止，研究人员发现在barX与barB下游共存在着7个基因(图3)，并进行了其功能的研究［22～26］(表2)。表2        弗吉尼亚链霉菌中barX和barB下游基因、表达产物及其功能

    (1)当VBs浓度低于一定水平时，BarA结合在DNA靶序列上，抑制靶基因转录。BarA可抑制自身编码基因产生，形成自我调节环路，使VBs浓度维持在一定水平。BarX可作为协同抑制因子加强BarA的DNA结合能力。当菌体在指数生长后期时，VBs浓度增加到临界值，VBs结合BarA脱离了DNA靶序列，被抑制的基因开始转录。BarA靶基因除自身编码基因barA外，还有barB、varS和varM。

    (2)barB-varS是双顺反子，共用一个转录单位，VBs结合BarA从barB启动子解离下来，开启barB-varS的转录，BarB暂时抑制vmsR的转录，直到菌体能够耐受自身产生的抗生素，推测该菌染色体中至少存在一个基因x，其表达产物X可激活vmsR的转录，VmsR激活VM1和VS生物合成基因簇，产生维吉霉素。此外，BarB作为负调控蛋白还控制着barB上游基因barZ与orf5的转录，具体调控机制尚不清楚。

    (3)BarA脱离barB启动子后，varM开始转录，产生VM1与VS抗性，但varS并没转录，因为varS-varR也是双顺反子，varR本底水平的转录产生VarR，VarR结合varS启动子序列抑制其转录，当菌体开始产生VS时，VS结合VarR使其脱离varS启动子，随之开启varS-varR的转录，使菌体产生VS抗性。

    (+)：激活；  (-)：抑制

    图4    VBs对维吉霉素与其抗性的调控网络

    3  IM-2型

    3.1  浅紫灰链霉菌中γ-丁酸内酯自动调控因子IM-2

    1989年，Sato等［27］发现一种因子(IM-2)能激发浅紫灰链霉菌中蓝色色素(blue pigment，BP)的产生，当IM-2浓度达到0.6ng/ml时就能诱导BP的产生。IM-2不但能开启BP与核苷酸抗生素的合成，还能关闭抗结核抗生素D-环丝氨酸(D-cycloserine，DCS)的产生［28］，但其生物合成过程有待进一步研究。IM-2的受体FarA以二聚体的形式存在，其氨基端也富含一种HTH结构域。体外实验显示，FarA作为抑制因子抑制其自身编码基因farA的转录，形成类似于VB型中的自我调节环路［29］。

    Kitani等［30］提出了参与次级代谢的IM-2-FarA系统的调控模型(图5)。与野生株相比，farA突变株产生更多的核苷酸抗生素，BP提前产生但产量更低，说明FarA对核苷酸抗生素的负调控起着主导地位，但对BP的调控并不是最主要的，可能还有一个额外的调控机制，目前尚不清楚；当菌体存在IM-2时，farA突变株的DCS产量明显提高，这说明IM-2与FarA同时存在对DCS的抑制是必需的。Kitani等［30］推测IM-2-FarA复合物可能作为一个整体起调控作用，目前正在寻找与该复合物结合的DNA片段，以便更进一步地阐述IM-2对次级代谢的调控网络。

    A：不存在IM-2；  B：存在IM-2；  (+)：激活；  (-)：抑制

    图5    IM-2-FarA对次级代谢的调控机制

    3.2  天蓝色链霉菌中γ-丁酸内酯自动调控因子SCBs

    近年来在天蓝色链霉菌中已鉴定了三种γ-丁酸内酯SCBs (SCB1、SCB2和SCB3)，也是一类IM-2型的自动调控因子，其中SCB1含量最为丰富［2］。SCBs产生于菌体过渡生长期，浓度达到0.25～0.5μmol即可诱发十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin，Red)与放线紫红素(actinorhodin，Act)产生［31］，而A因子早在菌体指数生长早期就产生了并一直积累下去。

    Takano等［32］发现在天蓝色链霉菌染色体上存在scbA，ScbA与AfsA同源性较高，具有类似于脂肪酸合成酶的活性，因此能生物合成SCBs［33］，但详细的生物合成过程尚不清楚。另一基因scbR与scbA临近并反方向转录，ScbR是SCB1的受体蛋白，有两个DNA结合位点(R位点与A位点)，分别位于scbR与scbA上游区域，SCB1的加入会解除ScbR的DNA结合能力［32］。最近研究发现，ScbR通过结合kasO的上游区域抑制其转录，该基因位于天蓝色链霉菌的聚酮I型生物合成基因簇中，是一种途径专一性调控基因，可激活该基因簇从而产生聚酮化合物，SCB1也可以解除ScbR对kasO的抑制，这是第一次报道链霉菌中一种自动调控因子受体可以直接控制参与次级代谢的途径专一性调控基因［34］。

    根据以上研究，SCBs对次级代谢的调控为(图6)：在菌体指数生长期中，scbR基础水平上的转录虽弱，但产生的少量ScbR通过分别结合位点R和A足以抑制scbR与scbA的转录，同时还抑制了kasO，scbA本底水平的转录只产生少量ScbA，无法产生SCBs；当菌体生长到过渡期时，开始产生SCBs，解除了ScbR的DNA结合能力，ScbR产生了自我调节的环路，ScbA也形成调节环路来控制SCBs的产生，而且还开启了kasO的转录，另外，ScbR可能以上述调控方式来控制参与Red和Act产生的一些基因，但目前尚未阐明。

    4  展望

    链霉菌中γ-丁酸内酯自动调控因子作用机制的研究已经取得了较大的进展，但仍有许多问题尚未解决：①BarA、FarA和ScbR是维持相应的γ-丁酸内酯产生浓度所必需的并且可形成自我调节环路抑制自身

    (+)：激活；  (-)：抑制

    图6    SCBs对次级代谢的调控网络编码基因的转录，而ArpA并不控制A因子的生物合成与其自身编码基因的转录；此外，与A因子相比，VB型与IM2型自动调控因子只控制次级代谢物的产生［35］，A因子型与VB型、IM-2型为什么有着如此显著的差别？②在VB的调控网络中，BarB与蛋白X如何相互竞争决定vmsR的转录，来最终控制维吉霉素的产生？BarB通过什么机制来控制pbarZ与orf5的转录？③在浅紫灰链霉菌IM-2-FarA系统调控中，FarA对BP的负调控并不占主导地位，可能还有一个额外的调控机制来控制BP，但尚未进一步阐明；④在天蓝色链霉菌中SCBs的受体ScbR如何来间接控制Red和Act的产生？

    随着链霉菌中自动调控因子研究的进一步深入，相信会给出更多的实验证据来解答上述问题。另外，γ-丁酸内酯和/或受体在非链霉菌属的放线菌中也广泛存在，如Kitasatospora setae的KsbA［36］、糖多孢红霉菌的SeaR［37］(一种VB型γ-丁酸内酯受体)等。因此这不仅可以认识链霉菌乃至放线菌中信号分子传递的调控机制，而且对于研究次级代谢物产量的提高具有重要意义。

【】
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