青藤碱对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤P-选择素和细胞间黏附分子-1表达的影响
作者：周素娴 苏珂 于健 彭鹰 周燕 林枫 李浩
【摘要】 目的探讨青藤碱( sinomenine ,Sin)对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤P-选择素和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法采用高脂高糖饮食加腹腔注射小剂量链脲霉素建立糖尿病大鼠模型，造模成功后将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Sin低剂量组和Sin高剂量治疗组。线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。Sin低（30 mg/kg），高剂量（60 mg/kg）治疗组于术前30 min分别给予大鼠腹腔注射。用免疫组化法观察缺血90 min再灌注24 h大鼠额顶部皮质P-选择素和ICAM-1表达，进行2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）染色和HE染色观察脑梗死体积及病理形态学变化。结果①糖尿病大鼠脑缺血再灌注24 h， P-选择素和ICAM-1表达均明显增加，与假手术组比较，差异具有显著性（均P<0.05）；与缺血再灌注组比较，Sin高、低剂量治疗组均显著减少P-选择素和ICAM-1表达（均P<0.05），高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。②Sin治疗组脑梗死体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。③Sin高、低剂量治疗组脑组织缺血损伤病改变明显轻于缺血再灌注组，Sin高剂量治疗组缺血改变亦轻于低剂量治疗组。结论Sin对糖尿病大鼠缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与减轻脑缺血再灌注损伤阶段P-选择素和ICAM-1所介导的炎症反应有关。
【关键词】 缺血再灌注；P-选择素；细胞间黏附分子-1；青藤碱
Abstract：ObjectiveTo study the effect of sinomenine（Sin） on expression of P-selectin and ICAM-1 following cerebral ischemia reperfusion(I/R) injury in diabetic rats.MethodsIn this experiment, rat model of diabetes mellitus was made by high sucrose, fat diet and streptozotion injection.Diabetic rats were randomly divided into 4 groups: sham operated group, I/R group,low dose Sin treated group and high dose Sin treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method. Sin were given intraperitoneally to rats 30min before focal cerebral ischemia operation respectively . After 90min MCAO following 24 h of reperfusion,we investigated the expression of P-selectin and ICAM-1 with immunohistochemistry in ischemic frontal and parietal cortex . HE staining and TTC staining were also investigated. Results ①Compared with sham operated group ,expression of P-selectin and ICAM-1 was increased at 24h of reperfusion in the ischemic territory(P<0.05). Compared with I/R group, low and high dose Sin treated group dose-dependently reduced the expression of P-selectin and ICAM-1 (all P<0.05).②Compared with I/R group,cerebral infarction volume in low dose Sin treated group and high dose Sin treated group was decreased dose-dependently (all P<0.05). ③The change of ischemic impairment in low or high dose Sin treated group was lighter than that of IR group,and high dose Sin treated group was lighter than that of low dose Sin treated group.ConclusionSin may reduce cerebral ischemia-reperfusion injury by decreasing the expression of P-selectin and ICAM-1in diabetic rats.
Key words：Ischemia-reperfusion; P-selectin ; ICAM-1；Sinomenine
目前研究表明,糖尿病是卒中的独立危险因素之一,而并发缺血性卒中的病死率可增高3 倍［1］。笔者前期研究证实［2］，脑缺血再灌注后炎症反应是造成再灌注损伤的主要原因之一。青藤碱( sinomenine ,Sin) 是从中药青风藤Sinomenium acutum Rehd etWils中提取的生物碱单体，它具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用。有实验表明［3］，Sin对细胞间黏附分子-1（ICAM-1）有抑制作用，但是否对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤P-选择素和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达有影响尚未见报道，本实验对此进行了相关研究。
1 材料
健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共50只，质量（250±30）g（广西医科大学动物实验中心提供）。大鼠喂饲高脂饲料（高脂饲料配方: 1%胆固醇、10%猪油、0. 2%丙基硫氧嘧啶、89%基础饲料［4］）。4周后, 单次空腹腹腔注射30 mg/kg链脲霉素(购于Sigma 公司)，继续高糖高脂饲料喂养,于注射后1，2 个月测定体重和血糖［5］ 。选择非空腹血糖16. 7～25. 6 mmol/L 的大鼠作为造模成功的糖尿病大鼠。经检测模型成功大鼠共45只，将其中40只大鼠按随机分组原则分为假手术组（10只）、缺血再灌注组（10只）、Sin低剂量治疗组（10只）及Sin高剂量治疗组（10只）。
2 方法
2.1 给药方法
Sin低剂量治疗组（30 mg/kg）和高剂量治疗组（60 mg/kg）均于术前30 min分别给予大鼠腹腔注射，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水腹腔注射。缺血再灌注组和Sin低、高剂量治疗组建立脑缺血90 min再灌注24 h动物模型。
2.2 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立
参照Longa等［6］方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。按照 Longa等［6］评分标准，各组分别在再灌注24 h进行神经功能缺陷评分。正常，无神经学征象为0分；动物不能完全伸展右前肢为1分；动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象为2分；动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚为3分；无自发活动，有意识障碍为4分。神经功能缺陷评分在1～3分为模型成功。0分和4分为模型不成功予剔除，在后续实验中补充剔除出组的动物，保证每组动物数。
2.3 P-选择素和ICAM-1的免疫组化染色
再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚5 μm。连取5张，1张作HE染色，其余4张作免疫组化染色。用SP法进行P-选择素和ICAM-1的免疫组化染色。一抗由武汉博士德生物工程公司提供。阴性对照片用PBS液代替一抗。在显微镜下以血管内皮细胞表面出现棕黄染色代表P-选择素和ICAM-1阳性反应血管为阳性结果。高倍镜（400×）下分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复视野，计数P-选择素和ICAM-1表达的阳性血管数，5个视野相加即作为每张切片阳性血管数的代表。
2.4 TTC染色
再灌注24 h，大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于－4℃冰箱20 min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2％TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用机病理图像分析仪及梯形法计算出梗死灶体积，各脑片梗死灶体积之和即为梗死体积。
2.5 HE染色
取再灌注24 h大鼠脑切片进行常规HE染色，观察病理形态学改变。
2.6 统计学方法
数据处理采用SPSS11.5统计软件进行运算，结果以±s表示，组间差异显著性检验采用方差分析。
3 结果
3.1 各组P-选择素和ICAM-1表达的比较
见表1。假手术组偶见P-选择素和ICAM-1阳性表达的血管。缺血再灌注组缺血侧可见P-选择素和ICAM-1表达，部位是微血管内皮细胞表面，主要分布于额顶部皮质和基底节区（见图1～2）。Sin低剂量组和高剂量治疗组P-选择素和ICAM-1表达较缺血再灌注组减少（均P<0.05）; 高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。表1 各组P-选择素和ICAM-1表达的比较（略）
3.2 各组脑梗死体积的比较
Sin高、低剂量组梗死体积较缺血再灌注组显著减小（均P<0.05），高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。
3.3 各组缺血侧脑组织病改变的比较
假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显（见图3）。缺血再灌注组呈缺血改变，梗死区正常组织结构消失，结构不清，间质水肿，有炎细胞浸润；锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红，并可见呈筛状坏死的坏死灶（见图4）。Sin不同剂量治疗组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻，高剂量组与低剂量组之间比较，缺血改变更轻。表2 各组脑梗塞体积的比较（略）
4 讨论
防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤茎称青风藤，Sin是从中提取的生物碱单体，在治疗类风湿性关节炎等各种风湿病以及心律失常中发挥了较好疗效。梁健等［7］给予青藤碱治疗正常血糖的脑缺血再灌注大鼠，显示青藤碱对缺血再灌注脑损伤有保护作用，但具体机制尚不清楚。本实验结果也表明，糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤给予不同剂量的Sin治疗，可明显减少脑梗死体积，减轻缺血造成的病理损害，并且高剂量Sin的脑保护效果更显著。
研究发现，炎症反应与脑缺血再灌注损伤密切相关。炎症反应的中心事件是中性粒细胞的浸润、聚集。而中性粒细胞聚集需要细胞黏附分子的桥梁作用。细胞黏附分子中的P-选择素合成并储存于血小板的α颗粒和内皮细胞的Weibel-Palade小体内，静息状态下不表达。ICAM-1是细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，亦是与炎症过程密切相关的黏附分子。脑缺血发生时，大量的细胞因子包括白细胞介素-1（IL-1）等促进P-选择素和ICAM-1表达，诱导中性粒细胞在微血管内皮细胞上滚动黏附聚集,并在其他细胞黏附分子的协助下, 中性粒细胞穿出血管壁进入脑实质,导致缺血区脑组织损伤。P-选择素和ICAM-1在中性粒细胞黏附迁徙过程中起重要的桥梁作用。近年研究表明，P-选择素和ICAM-1与糖尿病大血管和微血管病变密切相关，高糖环境可诱导P-选择素和ICAM-1等表达增加，中性粒细胞粘附增强［8，9］。本研究亦表明，糖尿病大鼠脑缺血90 min再灌注24 h，P-选择素和ICAM-1表达上调，表明P-选择素和ICAM-1参与脑缺血再灌注损伤阶段中性粒细胞与内皮细胞黏附过程，是缺血再灌注损伤血管内皮细胞炎性反应的标志。
近年来发现Sin具有抑制IL-1β，IL-8和核转录因子表达的作用［10～11］。另有实验表明［3］，Sin对ICAM-1有抑制作用。本研究通过给予Sin治疗糖尿病脑缺血再灌注损伤大鼠，显示Sin可显著抑制缺血再灌注损伤后P-选择素和ICAM-1表达的上调，减轻缺血再灌注损伤炎症反应，高剂量Sin的保护效果更显著。Sin对缺血再灌注损伤P-选择素和ICAM-1表达的抑制作用机制是否与减少IL-1等炎症细胞因子表达有关，将作进一步研究。
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