罐疗提高盐酸川芎嗪透皮吸收的研究
【摘要】 目的研究中医传统付罐疗法促进中药活性成分盐酸川芎嗪透皮吸收，优选最佳罐疗方法、条件。方法采用正交实验法，以中药活性成分盐酸川芎嗪24 h累积渗透量为测评指标，比较不同罐法、压力、罐疗时间对盐酸川芎嗪透皮吸收的影响。结果最佳罐疗条件为：刮罐、高压力、15 min。结论罐疗能显著地提高中药活性成分盐酸川芎嗪的透皮率，可以作为一种新的物理促进药物透皮渗透的方法。
【关键词】 罐疗 盐酸川芎嗪 透皮吸收 正交实验
研究发现，罐疗作用下皮部产生均匀散在的龟裂样裂缝，经型电镜观察测定，可穿透角质层，经原子示踪（In）测定，在内关穴处，可使透皮率提高3.8倍，为提高药物透皮率提供了一个物理方法:张力裂缝的方法。本项研究进一步证实了罐疗的此项作用，并结合中医传统罐法的留罐、颤罐、刮罐，在不同压力（低、中、高），不同罐疗时间（5，10，15 min）下，通过正交实验，优选出最优的罐疗提高中药活性成分盐酸川芎嗪透皮率的条件，进一步证实了罐疗可以作为一种新的物理促进药物透皮渗透的方法，为大幅提高靶向透皮药物的透皮率，提供一套新型的、实用的、可靠的方法。
1 仪器与材料
1.1 仪器
TK-12B型透皮扩散试验仪（上海铠凯科技贸易有限公司）；Waters 高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)，包括：Waters 515 双元泵， Waters 2487 可变波长紫外检测器, Waters SDC 柱温箱，威玛龙色谱工作站。
1.2 材料与试剂
盐酸川芎嗪贴剂（自制，分为8.76，17.52 cm2两种规格，每贴含盐酸川芎嗪150 mg)，氯化钠（成都金山化学试剂有限公司），甲醇（色谱纯,江苏汉邦科技有限公司），水为重蒸水。盐酸川芎嗪对照品（药品生物制品检定所 批号：0817-9803），付罐：贵阳中医学院研制，可适于不同的罐疗法。
1.3 动物日本种大白兔，雌雄兼用，体重2.1～2.3 kg，由贵阳医学院动物房提供。
2 方法与结果
2.1 罐疗方法［1］
2.1.1 留罐调定罐内压力，至规定时间时去罐。
2.1.2 颤罐将付罐施于穴位处，用压力调节阀不断调节罐内压力，至规定时间去罐。
2.1.3 刮罐调定罐内压力，来回移动付罐，至规定时间去罐。
2.2 透皮给药
2.2.1 离体兔皮的制备先用剪刀剪去兔背部的毛，再用电动理发器除去兔背部的绒毛，处死，剥取背部皮肤，小心去除皮下脂肪等组织，然后置1/1 000苯扎溴铵（新洁尔灭）溶液中浸泡30 min防腐，取出后用生理盐水反复冲洗，直至洗液澄清为止，剪成适当的大小，最后置于密封袋中，加入适量的生理盐水，放入冰箱中（－20℃）冷冻保存（两周内用完）。
2.2.2 扩散装置及介质采用TK-12B型透皮扩散试验仪。扩散池接收室中央部直径为1.93 cm，面积2.92 cm2，接受室容积为6 ml；接受液为P=0.9% NaCl溶液。
2.2.3 透皮贴剂的体外透皮实验实验前从冰箱中取出备用皮肤隔日融冻(0～5℃ )，用生理盐水反复淋洗至洗液澄清，滤纸吸干，调定罐内压力，按不同罐法施于皮肤，至规定时间后去罐，将盐酸川芎嗪贴剂贴于该处兔皮上（留罐、颤罐后皮肤处贴8.76 cm2贴剂，刮罐后皮肤处贴17.52 cm2贴剂），接受室加满扩散介质，以37℃水浴保温，磁力搅拌子以200 r/min的速度搅拌，间隔一定时间（1, 2, 4, 6, 8. 12, 16，24 h）取出接收室中全部接收液，立即补加等量的新鲜扩散介质。接收液以0.45 μm的微孔滤膜过滤，弃去初滤液，收集续滤液1 ml（必要时可将1 ml续滤液用生理盐水稀释至10 ml），进样测定。按下列公式单位面积累积渗透量：
Q= Cn×V/A Cn= C1十C2十……+Cj
式中Q为单位面积累积渗透量（单位：mg/cm2），A为接收池面积（单位：cm2），V为接收室体积(单位：ml)，j=1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24h
再按列公式计算不同罐疗方法后盐酸川芎嗪贴剂24h累积渗透量（mg）：
累积渗透量=Q×A
式中Q同上，A为盐酸川芎嗪贴剂面积（cm2）。
2.3 正交实验设计采用L9（34）交表进行实验，以盐酸川芎嗪24 h累积渗透量为测评指标，考察罐法、压力、罐疗时间3个因素对盐酸川芎嗪透皮吸收的影响。因素水平详见表1。表1 正交设计因素与水平（略）
由于不同的罐疗方法所对应的压力含义不同，所以［2］将不同罐法压力进行相对水平设计，见表2。
表2 不同罐法压力的相对水平设计（略）
压力由一次性注射器从付罐的一个压力调节阀抽不同体积空气来控制
2.4 含量测定
2.4.1 色谱条件色谱柱为美国Dikma DiamonsilTM C18 （5 μm, 250 mm×4.6 mm）；流动相为甲醇：水（50：50，V/V）；检测波长282 nm；流速1.0 ml/min；柱温30℃；灵敏度2AUFS；进样量：5 μl。在此分离条件下，分离良好。
2.4.2 标准曲线的绘制取盐酸川芎嗪对照品9.08 mg置100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度摇匀，即得对照品储备液。分别取对照品储备液0.1，0.5，1，3，5，7 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件和色谱系统下，依次进样（包括对照品储备液），以盐酸川芎嗪峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=9.85E-8X+2.56E-4 ，r=0.999 9，表明盐酸川芎嗪在0.908～90.8 μg/ml呈良好的线性关系。
2.4.3 最小检测量取盐酸川芎嗪对照品储备液进行稀释，按上述同样色谱条件进样分析，得盐酸川芎嗪的最小检测量为2.724 μg（信噪比为2∶1）。
2.4.4 精密度实验精密吸取浓度为0.045 4 mg/ml的盐酸川芎嗪对照品溶液重复进样5次，记录峰面积，RSD=1.24%；表明精密度较高。
2.4.5 稳定性实验精密吸取样品液分别于0，1，2 ，4，24 h进样测定5次，记录峰面积， RSD=2.57%，表明稳定性较好。
2.4.6 加样回收实验分别向已知含量的样品液中加入一定量盐酸川芎嗪标准品，测定峰面积，测定平均回收率为99.82%，RSD=2.3%。
2.5 罐疗后贴剂的体外透皮释药实验结果按表2安排实验，按“2.1”项下、“2.2”项下操作，每隔一定时间（1，2，4，6，8，12，16，24 h）取出全部接收液，按“2.2.3”项下方法处理，进行测定，并结果。结果见表3。表3 不同罐疗方法后盐酸川芎嗪贴剂24h累积渗透量（略）
2.6 实验结果的优化处理以不同罐疗方法后盐酸川芎嗪24 h累积渗透量为指标，将实验方案及目标值数据输入计算机，利用正交设计助手软件对结果进行分析。见表4。表4 正交实验设计及结果（略）
通过表4由极差R值进行分析可知，各指标因素的主次顺序：A＞B＞C；由均值可得，最优方案为A3B3C3。方差分析见表5。表5 方差分析（略）
F0.05(2,2)=19 由方差分析表可知，A因素（罐法）有显著影响，B因素（压力）和C因素（时间）影响较小。最佳罐疗条件选择：罐法为刮罐、高压力、罐疗时间15 min。
选择最优的罐疗条件（刮罐、高压力、15 min），按“2.2.3”项下进行了3次透皮实验，按前法测量24 h盐酸川芎嗪累积渗透量，其平均值为（62.186 4±0.036 33 ）mg。可见用正交设计优选出的结果可靠，按最优罐疗方法罐疗后，盐酸川芎嗪24 h累积渗透量优于正交设计中的各罐疗方法，重复性较好。
2.7 罐疗与未罐疗经皮渗透曲线比较将采用罐疗和未采用任何促渗透手段两者盐酸川芎嗪的经皮渗透曲线比较（以累积渗透量为纵坐标，时间为横坐标）。结果见图1。
3 讨论
川芎嗪是伞形科植物川芎中最主要有效成分之一，分子量小，熔点低且易挥发，已证实有良好的透皮性能。川芎嗪是临床上广泛使用的改善微循环和脑血流的药物，主要用于脑血栓形成、脉管炎、冠心病等心脑血管疾病的［3］。药动学研究表明，川芎嗪以口服或肌注方式给药具有吸收、排泄半衰期短（2.8 h）的特点，每日需频繁给药以维持有效血药浓度，长期用药十分不便。因此我们选择盐酸川芎嗪作为透皮吸收药物，进行罐疗提高药物透皮吸收的研究。
罐疗与未罐疗经皮渗透曲线的比较，表明罐疗能显著地提高中药活性成分盐酸川芎嗪的透皮率，刮罐后盐酸川芎嗪达峰值显著比颤罐、留罐高，透过量大，血药浓度整体水平高。刮罐后，随着用药而积增大，透过量比颤罐高。由于是体外透皮实验，皮肤失去自我修复能力，所以随着罐疗时间的延长，单位面积透过量继续增大。
以罐法、压力、时间3个因素，每个因素选3个水平，采用正交设计安排实验，盐酸川芎嗪24 h累积渗透量为测评指标，利用高效液相色谱法测定，优选出最佳罐疗条件即：刮罐、高压力、15min。该实验结果表明：罐疗能显著地提高中药活性成分盐酸川芎嗪的透皮率，罐法、罐疗压力、罐疗时间3个因素都影响着透皮效果，其中最显著的影响因素是罐疗方法。验证实验表明该结果可靠，进一步证实了罐疗可以作为一种新的物理促进药物透皮渗透的方法。
本课题是祖国传统医学与技术结合的尝试。即利用中医传统付罐疗法促进现代透皮吸收制剂的透皮吸收，提高其生物利用度，减少给药次数，充分发挥现代透皮吸收制剂的优点。由于付罐携带、使用方便，对人体伤害小，因此这一新型物理促渗透方法有着良好的前景。
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［1］张永萍，邱德文，林亚平，等. 罐疗提高盐酸维拉帕米透皮吸收的研究［J］. 贵阳中医学院学报，2002，24（1）：57.
［2］徐莲英.中药制药工艺技术解析，第1版［M］.北京：人民卫生出版社，2004：292.
［3］北京制药研究所.川芎嗪有效成分的研究-川芎嗪的药理研究［J］.中华医学杂志，1977，57：464.
