地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞Tea-8113的抑制作用

【摘要】  目的研究地鳖虫蛋白对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制作用，探索地鳖虫蛋白质的抗肿瘤活性。方法采用MTT法测定地鳖虫蛋白质对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制效果。结果地鳖虫蛋白质在体外能显著抑制人舌癌细胞Tea-8113的增殖，药物浓度0.0902 g·ml-1，药物作用72 h抑制率最高，达到92.96％，并呈现明显的药物剂量依赖关系。结论地鳖虫蛋白质有较强的体外抗肿瘤活性。

【关键词】  地鳖虫活性蛋白 Tea-8113细胞 MTT法 抗肿瘤活性

    Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of protein of Eupolyphaga on human tongue cancer cell line Tea-8113.MethodsThe MTT assay was used to examine the proliferation inhibitory activity.ResultsThe protein of Eupolyphaga had obvious anti-proliferation activity on Tea-8113 in vitro in concentration and time dependent manners, the inhibition rate was up to 92.96％ for 0.0902 g/ml and 72 hours.ConclusionThe protein of Eupolyphaga has an obvious inhibitory effect on the proliferation of Tea-8113 in vitro.

    Key words： Protein of Eupolyphaga；   Tea-8113 cell line；   MTT assay；  Antineoplasmic activity

    地鳖虫Eupolyphaga sinensis Walker 又名土元，土鳖, 是《药典》记载的正品动物类药材，具有破瘀血、续筋骨、消肿止痛等药用功效 ［1］ ，临床主要用于淤血阻滞,癥瘕积聚,跌扑损伤等症。中医处方亦用其治疗肿瘤，目前将其用于治疗消化道肿瘤的较为普遍［2］ 。本实验室前期工作已证实地鳖虫提取物（Extract from Eupolyphaga sinensis Walker ，EES）对肿瘤细胞有显著的细胞毒性作用 ［3］ 。为了深入探讨EES的抑瘤作用，本文以新鲜地鳖为原料,采用硫酸铵分段盐析,离子交换和SDS-PAGE电泳分析等方法，分离得到地鳖蛋白，探讨该蛋白质对舌癌Tea-8113细胞生长、增殖的影响，为EES抗肿瘤临床应用及其作用机制的深入研究提供实验依据。

    1  材料与仪器

    1.1  细胞株 人舌癌Tea-8113细胞株由中山大学附属肿瘤细胞库提供，用含10％小牛血清、100U /ml青霉素和100 U /ml 链霉素的RPMI1640培养基，37℃，5％CO2 培养箱中，完全饱和湿度条件下培养，3～4 d 传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

    1.2  药物及试剂地鳖虫成虫（雌性）购自广州市花鸟市场，由广东大学生药研究室鉴定。RPMI1640培养液、小牛血清均为美国GIBCO公司产品，MTT（噻唑兰）、二甲基亚砜、胰蛋白酶均为美国AMRESCO公司产品，超纯水自制，其余试剂均用国产分析纯。常规培养。

    1.3  仪器CO2培养箱为美国SHEL LAB公司产品，倒置显微镜购自重庆奥特光学公司，超净工作台为苏净集团产品，680型酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

    2  方法

    2.1  地鳖虫活性蛋白质（EES）的制备取200 g新鲜地鳖虫剪碎，加入200 ml预冷的0.01 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4),匀浆，再加300 ml上述缓冲液，4℃浸提过夜，4 000 r/min 离心20 min，弃沉淀，上清用sevag法提取蛋白质，收集40%～65%饱和度盐析组分［4］，透析除盐，层析分离并收集蛋白质组分，洗脱液为含1.0 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液梯度洗脱,恒流泵流速为40，10 min收集1管。分别收集各蛋白峰液体，真空冷冻将蛋白质制成粉末备用。

    2.2  SDS-PAGE电泳［5］采用SDS-PAGE法分析制备蛋白质组成。浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12％，考马斯亮蓝G－250染色，甲醇/冰乙酸脱色。由低标准蛋白质绘制标准曲线，测定测试样品的迁移距离，相对迁移率(mR)，由标准曲线求得测试样品的分子量。

    2.3  地鳖虫活性蛋白对人舌癌Tea-8113细胞的体外抑制作用（MTT法）［6］用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的Tea-8113细胞，将5.0×104／ml细胞悬液接种于96孔培养板中, 每孔100 μl，培养15 h细胞贴壁后，分别加入PBS(阴性对照)以及终质量浓度（0.010 1，0.030 2，0.050 1，0.070 2和0.090 2 g/ml）的EES各20 μl，每组均设4个复孔。置饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养24，48，72 h, 结束前4～6 h各培养孔分别加入5mg/ml MTT 20 μl, 继续培养4 h，弃培养上清液, 每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200 μl溶解液，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(A)值, 测定波长为490 nm , 用不含细胞培养液而同样作其他处理组作本底,校正测量值,取4孔A值平均数,按以下公式计算抑制舌癌细胞的生长抑制率。

    细胞增殖抑制率（％）=［1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)］×100％

    2.4  统计学处理统计学分析采用SPSS10.0软件，结果以±s表示。实验均重复3次。

    3  结果

    3.1  地鳖虫活性蛋白质（EES）的分离纯化地鳖虫经匀浆、盐析、透析得到EES粗提物，将该粗提物上DEAE-32纤维素离子交换柱层析，介质经预处理后装柱，柱预先用0．05 mol／L，pH 7．8的PBS平衡，上柱后用含1.0 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液梯度洗脱至在280 nm波长无光吸收。洗脱液出现3个蛋白峰（见图1），分别收集各峰蛋白质，经检测峰1和峰2蛋白质含量较低，峰3蛋白质含量较高。进一步对各蛋白峰进行MTT检测，蛋白峰1和蛋白峰2组分对Tea-8113细胞增殖无显著抑制作用，而蛋白峰3组分能够显著抑制肿瘤细胞的生长。

    图1  DEAE-32纤维素离子交换层析柱洗脱EES

    3.2  SDS-PAGE电泳结果取DEAE一纤维素离子交换层析的活性峰3蛋白液进行SDS-PAGE电泳，脱色后呈现一清晰蛋白带，表明该蛋白纯化效果良好，蛋白质基本为单一组分，测得其相对分子质量为41.3KD。见图2。

    图2  EES的SDS-PAGE电泳图

    3.3  地鳖虫活性蛋白（EES）对Tea-8113细胞的增殖抑制作用 结果显示，5个EES浓度（0.010 1，0.030 2，0.050 1，0.070 2和0.090 2  g/ml）处理组在3个处理时间内，舌癌Tea-8113细胞增殖被抑制的情况为：24 h 后细胞的增殖抑制率分别为8.53%，16.37%，26.96%，53.14%和92.06%；48 h 后，细胞的增殖抑制率分别为-4.71%，10.91%，33.14%，84.22%和91.90%；72 h 后，细胞增殖抑制率分别为6.51%，37.07%，46.92%，69.58%和92.96%，显然，这3个处理时间5个浓度处理组均较对照组明显增高（见表1）。说明EES具有抑制Tea-8113细胞增殖作用，且对该类癌细胞增殖抑制作用具有明显的时效和量效关系,随着药物质量浓度的增大和作用时间的增加，Tea-8113细胞增殖的抑制率逐渐增大。当药物浓度为0.090 2 g/ml，作用时间72 h，抑制率达92.96％。相同浓度地鳖虫活性蛋白与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，作用48 h与72 h 无显著差异。表1  地鳖虫活性蛋白（EES）对Tea-8113细胞增殖的抑制作用

    4  讨论

    本实验结果表明, 浓度为0.010 1，0.030 2，0.050 1，0.070 2和0.090 2 g/ml 的地鳖虫活性蛋白对人舌癌Tea-8113细胞有显著的抑制其增殖作用。统计学分析表明: 不同浓度的地鳖虫活性蛋白对相同肿瘤细胞抑制增殖作用的效果不同, 具有明显的浓度和时间依赖性, 差异显著( P< 0.05)。

    当细胞数量明显减少，其必然为细胞增殖受到抑制或死亡细胞数量增加这两种现象。由于细胞分裂增殖的实质就是DNA 的复制, 通过细胞不断经历细胞周期来实现,而细胞周期受细胞内信号传导和多种因素的精细调节,特别是G0/G1 期细胞对外界环境因素敏感并能被刺激, 从而加快或减缓细胞增殖。当细胞周期发生障碍时, 细胞增殖将受到抑制, 而DNA 合成障碍是细胞周期发生障碍的较常见原因。本研究以一定浓度地鳖虫活性蛋白处理细胞后，细胞增殖受到极大抑制，我们认为这种抑制作用不仅仅是直接杀伤肿瘤细胞，一定对细胞增殖过程DNA的复制有所影响。其机制还有待于进一步的研究加以证实。

【】
  ［1］ 国家药典委员会.药典，Ⅰ部［S］.北京:化学出版社,2005:56.

［2］ 邹 玺,刘宝瑞，钱晓萍，等.土鳖虫提取液对人胃低分化腺癌细胞BGC-823的抑制作用［J］.时珍国医国药,2006,17(9):1695.

［3］ 韩雅莉,谢 昆.土鳖虫糖蛋白的提取及抗肿瘤活性初步研究［J］.汕头大学学报,2006,21(4):46.

［4］ 韩雅莉,李张伟.地鳖纤溶活性蛋白的纯化及性质研究［J］.生物工程学报,2006,22(4):639.

［5］ 汪家政,范 明.蛋白质技术手册［M］.北京：出版社,2000:77.

［6］ 张 微，邹 玺，钱晓萍，等.土鳖虫含药血清对肝癌Hep G-2细胞增殖的抑制作用［J］.中药新药与临床药理,2007，7（18）:257.