五指毛桃药材高效液相指纹图谱的实验研究
作者：席萍 黄耀海 黄月纯 蔡庆群 曹艳芳
【摘要】 目的建立五指毛桃药材的高效液相(HPLC)指纹图谱。方法采用高效液相色谱法，选用XDB－C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）。 柱温25℃；检测波长246 mm。流动相为甲醇-水。梯度洗脱：0 min，甲醇-水（15∶85）；20min，甲醇-水（55∶45），40 min；甲醇-水（85∶15）；45 min，甲醇-水（100∶0）；50 min，甲醇-水（15∶85）。流速1 ml/min；运行时间50 min；检测波长为246 nm。结果五指毛桃药材共有9个共有峰。 结论实验方法可行，可为检测五指毛桃药材质量控制标准提供。
【关键词】 五指毛桃 指纹图谱 高效液相色谱法
五指毛桃（Radix Fici）为桑科植物粗叶榕Ficus hirta Vahl.的干燥根。最早称为无爪龙，记载于清代的《生草药性备要》，目前临床使用习称五爪龙，许多大型中药工具书称之为五指毛桃，商品名亦称五指毛桃［1］。2004年版《广东省中药药材标准》将其以五指毛桃的名称列入标准中［2］。本品为华南地区常用中药材，味甘，性平，有健脾补肺、利湿舒筋功能，主治脾虚浮肿、食少无力、肺痨咳嗽、盗汗、带下、产后无乳、风湿痹痛、水肿、肝硬化腹水、肝炎、跌打损伤，临床疗效显著。梅州地区宜将其作为食疗常用品，家喻户晓。研究表明五指毛桃药材的化学成分主要是补骨脂素以及佛手内酯、油酸、亚油酸、十六酸、十八酸等成分，这些成分在沸水中煎出均能产生香气,民间习惯以其香味的浓郁程度来判断其质量的优劣。
据检索有关五指毛桃的栽培技术研究［3］，组织培养研究［4］、挥发油成分的分析［5，6］、以及测定其成分含量的薄层扫描法研究［7］等均有报道。但对五指毛桃药材指纹图谱的研究却未见报道，为更好地评价五指毛桃药材质量的均匀性和稳定性，提高其质量控制标准 ，我们收集了不同产地五指毛桃药材，采用高效液相色谱法，建立了五指毛桃药材的指纹图谱分析方法。
1 器材
1.1 仪器高效液相色谱仪 (HP-1100，安捷伦) ；二极管阵列检测器（DAD）；色谱柱：XDB－C18（4.6 mm×250 mm,5 μm，安捷伦）。
1.2 试药甲醇(色谱试剂,批号051105101,天津市四友生物医学技术有限公司)；水为超纯水；补骨脂素对照品（739-200209） (由药品生物制品检定所提供)；样品：五指毛桃药材共9批（见表1），均为当年新鲜采集晒干，委托广州致信中药饮片公司在各地收集并鉴定。见表1。
表1 五指毛桃药材来源（略）
2 方法
2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersi1 ODS(250 mm×4.0 mm；5 μm)；流动相，甲醇-水；梯度洗脱条件：0 min，甲醇-水（15∶85）；20 min，甲醇-水（55∶45）；40 min，甲醇-水（85∶15）；45 min，甲醇-水（100∶0）；50 min，甲醇-水（15∶85）；流速，1 ml/min；柱温为室温；进样量，10 μl；检测波长246 nm。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素对照品0.79 mg，加甲醇制成0.395 mg/ml的溶液，摇匀，即得。
2.3 供试品溶液的制备 称取五指毛桃药材粉末约5 ｇ，置锥形瓶中，加入甲醇50 ml，浸泡过夜，超声处理30 min，滤过。滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至1 ml。
2.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录50 min的色谱图。
3 结果
3.1 精密度实验 取同一份供试品溶液，连续进样5次，其色谱峰保留时间的RSD均在0.3%以内，峰面积的RSD均在5%以内。保留时间和峰面积基本无明显变化，符合指纹图谱技术要求。
3.2 稳定性实验取同一份供试品溶液，分别在0，2，4，6，12 h处检测，其色谱峰保留时间的RSD均在0.2%以内，峰面积的RSD均在5%以内。表明样品溶液在12 h内稳定。
3.3 重复性实验取同一批样品如法制备供试品5份检测，其色谱峰保留时间的RSD均在0.3%以内，峰面积的RSD均在5%以内。保留时间和峰面积基本无明显变化，表明方法重现性较好。
3.4 主要色谱峰的建立 分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录50 min的色谱图。检测指认结果9批五指毛桃药材的指纹图谱，与参照物补骨脂素的色谱峰（S）相对应的位置上，有一主要色谱峰，其占总峰面积的百分比约为50.26％～62.27％。50 min内有9个色谱峰是9批五指毛桃共有的。其在5号峰和6号峰（保留时间约在23.5 min和27 min）的位置更具有特征性，为主要共有峰，5号峰对应为补骨脂素的色谱峰（S）。因此，最终确定9个色谱峰为共有指纹峰见图1，共有指纹峰的保留时间见表2，峰面积百分含量见表3。
图1 五指毛桃药材色谱峰图（略）
表2 9批五指毛桃样品共有指纹峰的保留时间（略）
表3 指纹图谱主要共有峰的峰面积百分含量（略）
3.5 样品指纹图谱相似度分析 五指毛桃9批药材样品指纹图谱与相似度机软件（SPSS）得出的共有模式相比较，其相似度结果见表4。
4 讨论
由于五指毛桃药材成分复杂，实验中选择单一流动相无法达到很好的分离效果，而采用梯度洗脱可以在整个分析时间段（50 min）内，各色谱峰峰形尖锐，并能尽可能多地对各组分进行很好的分离，达到较好分离效果。我们考察了甲醇－水不同比例以及不同洗脱梯度的试验，结果表明，本实验所采用的流动相：0 min，甲醇-水（15∶85）；20 min，甲醇-水（55∶45）；40 min，甲醇-水（85∶15）；45 min，甲醇-水（100∶0）；50 min，甲醇-水（15∶85）。其分离效果较好。
在检测波长的选择中，采用二极管阵列检测器（DAD）检测，在215，246，270，290和320 nm中的色谱图进行比较，结果在246 nm处的色谱图中出峰较多，峰形较好，而且是五指毛桃药材主要成分补骨脂素的最大吸收波长,因此我们选取246 nm作为其指纹图谱的检测波长。
表4 与共有模式比较的五指毛桃样品相似度评价（SPSS软件）（略）
实验中制备五指毛桃样品液，我们选择7种提取溶剂系统即50%甲醇，甲醇，乙醇，醋酸乙酯，乙醚，氯仿，石油醚进行考察。结果显示在同样超声30 min的情况下，以甲醇的提取效果最佳。而对提取方法的考察，以甲醇为提取溶媒，分别采用浸泡24 h，加热回流2 h，索氏提取4h和超声提取30 min等4种提取方法的提取效率，发现甲醇热回流和甲醇超声提取对五指毛桃药材进行处理所得色谱图峰数较多，更能体现药材原有的面貌。经过实验比较，用甲醇超声提取30 min的操作相对简单，效果较佳，最后选定其作为本实验的提取方法。
实验结果显示，五指毛桃1～7号样品相似度均达到95%以上，说明其指纹图谱具有较高的相似性。8～9号样品相似度偏低，与其药材中参杂较多的茎枝部分有关。五指毛桃的药用部位主要是根，但据市场情况来看，不同地区采用根茎混用的情况是存在的。
测定结果表明，不同产地的五指毛桃药材指纹图谱的9个共有峰保留时间，均具有较好的重现性； 其中，1号样品各号峰均齐全，共有峰面积大，5号峰和6号峰的峰面积百分含量高，初步认为它的质量最好，这与有关河源产地的五指毛桃质量检测最佳的研究报道相符［8］；同样源于河源产地的2号样品，其各号峰也较齐全，但与样品1相比，其4号峰异常的高，且缺少8号峰，由于它们分别购于不同的时间段，究竟是何原因造成这种差异，有待日后的调查研究。
因实验条件限制，我们没能在各个产地采集多批次的样品进行试验，本实验也只是对五指毛桃药材指纹图谱作初步的探讨研究，为提高其质量控制标准提供检测方法。
【】
［1］ 钟小清,徐鸿华.五指毛桃品种考证［J］.中药材，2000,23(6)：361.
［2］ 广东省食品药品监督管理局.广东省中药药材标准,第1册［S］.广州：广东科技出版社,2004:35.
［3］ 钟小清,徐鸿华,陈安琴.五指毛桃栽培技术［J］.中药研究与信息，2000,2(7):17.
［4］ 蒋 林,黄清春,等.五指毛桃组织培养研究［J］.中药材，2004,27(8)：547.
［5］ 林 励,钟小清,魏 刚.五指毛桃挥发性成分的GC-MS分析［J］.中药材，2000,23(4)：206.
［6］ 刘春玲,魏 刚,等.五指毛桃不同采收部位挥发油及醇提物成分的分析［J］.广州中医药大学学报,2004,21(3)：204.
［7］ 陈 勇,甄汉荣,陈美燕.五指毛桃中补骨脂素的含量测定［J］.中药材,2002，25(4)：265.
［8］ 刘春玲,徐鸿华.高效液相色谱法测定五指毛桃中补骨脂素的含量［J］.中药材，2004,27(8):582.
