番石榴叶总黄酮提取工艺研究
【摘要】 目的为充分利用番石榴叶资源，优选番石榴叶总黄酮的最佳提取工艺。方法以总黄酮含量为考察指标，采用正交设计的方法研究提取番石榴叶总黄酮的工艺条件。结果影响番石榴叶总黄酮提取效果的主次因素为：乙醇浓度>回流时间>提取次数>溶剂用量。结论番石榴叶总黄酮最佳提取工艺为10倍量70%乙醇加热回流提取两次，2h/次。
【关键词】 番石榴叶； 总黄酮； 正交设计
Abstract：ObjectiveTo study an extraction technology for total flavones from leaves of Psidium guajava L. MethodsThe extraction conditions of total flavones were studied through measuring the content of the total flavones extracted.ResultsThe factors which influenced the extraction rate were sorted as follows: A > D > C > B, where A , B, C, D stood for the concentration of ethanol, the dosage of ethanol, extraction times and heated times . ConclusionThe optimum process of the extraction technology which obtained through orthogonal design is: 70% ethanol, ten-fold solvent, two times extraction, two hours each time.
Key words：Psidium guajava Leaves; Total l flavones; Orthogonal design
番石榴叶为桃金娘科植物番石榴Psidium guajava L.的干燥叶及带叶嫩茎，分布于华南各地至四川西南部，含β-谷甾醇、榭皮素、番石榴苷、无色车菊素、番石榴酸等成分［1］。药理研究表明，番石榴叶提取出的总黄酮苷及单黄酮苷具有降血糖的作用［2］；近年来对黄酮类化合物的药理作用研究较多，发现其具有抗心脑血管病、抗氧化、镇痛、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用［3，4］。为了进一步研究番石榴叶总黄酮的功效，充分开发我国丰富的番石榴叶植物资源, 我们以总黄酮含量为考察指标，对番石榴叶总黄酮提取工艺进行了研究。
1 材料与仪器
1.1 仪器722N型分光光度计（上海精密仪器有限公司）；SHBⅢ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；ZFQ85A旋转蒸发仪(上海医械专机厂)；AL204天平（METTLER TOLEDO），HWS-20恒温水浴箱（江苏太仓市实验设备厂）。
1.2 试剂芦丁对照品（药品生物制品检定所)；番石榴叶（购自广西药材站)， 95%乙醇；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠等皆为市售分析纯。
2 方法与结果
2.1 番石榴叶总黄酮的提取取干番石榴叶，粉碎，准确称取50g，置于1000ml圆底烧瓶中，按要求加入一定量的提取剂，加热回流提取一定时间，滤过，滤液减压回收溶剂，真空干燥，称重，得待测番石榴叶干膏。
2.2 总黄酮含量测定方法
2.2.1 测定波长的确定精密称取干燥芦丁对照品20 mg，置100 ml容量瓶中，60%乙醇溶解，定容，得标准对照液（含无水芦丁0.200 0g/L）。精密移取芦丁对照液2.0 ml置25 ml容量瓶中，加入50g/L亚硝酸钠溶液0.75 ml，摇匀，静置6 min；再加100g/L硝酸铝溶液0.75 ml，摇匀，静置6 min；再加40 g/L氢氧化钠溶液10 ml，60%乙醇稀释至刻度,摇匀，静置10min，以60%乙醇调零，从200 nm至600 nm进行全波长扫描，测得500 nm处有最大吸收，因此以500 nm为测定波长。
2.2.2 标准曲线绘制分别精密移取芦丁标准对照液0，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5ml置25ml容量瓶中，按“2.2.1”项下“加入50 g/L亚硝酸钠溶液”起操作，以第一瓶溶液为空白调零，于500 nm测各瓶溶液吸光度；以浓度（ C ）和吸光度（ A ）进行线性回归，得方程为：A = 9.975 4C - 0.003 5；r= 0.998 9。
2.2.3 精密度实验精密吸取芦丁对照液2.0 ml置25ml容量瓶中，按“2.2.1”项下操作，60%乙醇调零，于500 nm测溶液吸光度，结果RSD 为0.85%（n=6）。
2.2.4 稳定性实验将同一待测番石榴叶干膏按样品总黄酮含量测定方法项下操作，分别于0，2，4，6，8 h进行测定，结果RSD 1.27% ，表明各供试品溶液中总黄酮在测定的8 h内可保持稳定。
2.2.5 重复性实验将同一待测番石榴叶干膏按样品总黄酮含量测定方法项下操作，平行测定6次，结果RSD为1.84%。
2.2.6 回收率实验采用加样回收法。精密称取已知含量的样品5份，分别加入精密称定的对照品适量，按样品总黄酮含量测定方法项下操作，测定吸光度并回收率，结果平均回收率为96.86% ，RSD为0.82%。
2.2.7 番石榴叶样品总黄酮含量测定精密称取不同提取条件所得番石榴叶干膏12 mg，置10 ml容量瓶中，60%乙醇溶解，定容，精密移取5 ml置25 ml容量瓶中，按“2.2.1”项操作，60%乙醇调零，于500 nm测溶液吸光度，根据回归方程计算总黄酮浓度，并计算样品总黄酮含量。
总黄酮量（mg）= 总黄酮浓度 ×溶液体积×样品干膏量 / 6
总黄酮含量（%）=（总黄酮量/干药材量）×100%
2.3 提取工艺研究由于乙醇作为提取溶剂具有选择性好，渗透性强，浸出率较高的优点，因此本实验选择一定浓度的乙醇溶液作为提取剂。根据预实验结果，选择溶剂浓度、溶剂用量、提取次数、回流提取时间4个因素进行正交设计，选用L9(34)正交表，因素水平表见表1。
按表2所列各工艺组合制备样品，按“2.2.7”项方法测定，计算总黄酮含量。结果见表2。方差分析见表3。由分析结果可知影响番石榴叶总黄酮提取的主次因素依次为乙醇浓度>回流时间>提取次数>溶剂用量；其中乙醇浓度对提取率的影响有显著性差异（P<0.05）；提取的最佳方案为A2B1C2D2，即10倍量70%乙醇加热回流提取两次，2h/次。
表1 正交设计因素水平表（略）
表2 正交实验方案及结果分析 L9(34)（略）
表3 方差分析表（略）
3 讨论
番石榴叶总黄酮是番石榴叶主要成分，我们经正交设计的直观分析和方差分析，发现影响番石榴叶总黄酮提取的主次因素依次为乙醇浓度>回流时间>提取次数>溶剂用量，提取的最佳方案为A2B1C2D2，即10倍量70%乙醇加热回流提取两次，2 h/次。按此方案提取，所得总黄酮含量最高。
【】
［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(第5册)［M］.上海:上海技术出版社,1998: 642.
［2］ 黎肇炎, 曾宝月, 简锦溢,等. 番石榴叶提取黄酮甙对实验性四氧嘧啶性糖尿病大白鼠及正常大白鼠的降糖作用［J］ . 广西医学院学报, 1980 , 1 : 19.
［3］ 曹纬国,刘志勤,邵 云,等.黄酮类化合物药理作用的研究进展［J］.西北植物学报,2003,23（12）：2241.
［4］ 黄河胜,马传庚,陈志武,黄酮类化合物药理作用研究进展［J］.中药杂志,2000,25 （10）:589.
