沉香随机扩增多态性DNA反应体系的建立

                      作者：邵敏 周鹤峰 唐历波 刘银花 李官成

【摘要】  　　目的对影响沉香随机扩增多态性DNA（RAPD）反应的各因素进行优化，建立适用于沉香RAPD的最佳反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA，变化单一因素的方法对模板 DNA浓度、Taq酶用量、dNTPs、引物浓度、Mg2+浓度、退火温度对RAPD影响进行分析。结果建立了适合沉香RAPD分析的最佳反应体系：在20μl反应体系中，模板DNA用量20 ng、Taq酶1.0 U、dNTPs浓度为0.3～0.4 mmol·L-1、随机引物浓度为0.6 μmol·L-1、Mg2+浓度1.5～2.0 mmol·L-1。PCR反应条件：94℃，10 min；94℃，1 min；36℃，1 min；72℃，2 min；45个循环，72℃，8 min。结论该反应体系具有良好的稳定性和重复性。

【关键词】  沉香； RAPD； 基因组DNA； 反应体系

　　Abstract：ObjectiveTo establish the optimum RAPD reaction system of Aquilaria agallocha Roxb.MethodsThe genomic DNA was extracted from Aquilaria agallocha Roxb. by modified CTAB method,and the different Template DNA,Taq,dNTPs,Primer,Mg2+，the annealing temperature were analyzed. ResultsThe optimized reaction system and program of RAPD for Aquilaria agallocha Roxb. were as follows:The reactions were performed in a volume of 20μl，which containing 20ng DNA,1U Taq ploymerase, 0.3～0.4 mmol·L-1 dNTPs,0.6 μmol·L-1 random Primer,1.5～2.0 mmol·L-1 Mg2+.After pre-denaturing at 94℃ for 10 min,under the condition of denaturing at 94℃ for 1 min,annealing at 36℃ for 1 min,extension at 72℃ for 2 min,amplifying for 45 cycles,finally extension at 72℃ for 8 min. ConclusionThe reaction system is reproducible and highly stable.

　　Key words：Aquilaria agallocha Roxb.;   RAPD;   Genomic DNA;   Reaction system
   
　　沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg含有树脂的木材［1］，是一种热带亚热带常绿乔木。白木香是我国生产沉香药材唯一的植物资源，主要分布于广东省东南部、西南部、中部以南地区和海南，属国家二级保护野生植物。沉香是临床常用的理气药，具行气止痛、温中止嗳、纳气平喘功效，用于胸腹胀痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症。据统计，建国至今有一千六百多个药方使用沉香；另外，沉香树是很好的园林绿化树种，又是珍贵的天然香料。长期以来由于森林资源、生态环境遭受灾害和人为破坏，天然沉香资源日趋枯竭。在现有的资料中，对白木香的研究主要集中在组织培养和化学成分等方面，遗传学方面的研究尚未见报道。
   
　　随机扩增多态性DNA技术(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)是1990年由Williams等［2］在聚合酶链式反应(PCR)基础上建立的新的检测基因组多态性的基因分型技术，被广泛运用于分类学、物种亲缘关系、动植物品系鉴定、特定性状分子标记以及基因定位、遗传图谱构建等各个方面。运用RAPD技术对沉香进行遗传多样性的研究过程中，需要建立标准化、稳定的反应体系。
   
　　本实验对影响RAPD反应的主要因素，如模板DNA的浓度、引物浓度、镁离子浓度、Taq酶用量等进行研究，以期建立沉香RAPD最佳反应体系，为进一步应用RAPD技术对沉香遗传稳定性的研究奠定基础。

　　1  器材与方法

　　1.1  材料沉香购于海南屯昌英扬沉香开发有限公司，经遵义医学院唐历波副教授鉴定为瑞香科植物白木香含有树脂的木材。

　　1.2  试剂与仪器  Taq酶、dNTPs、MgCl2、随机引物、琼脂糖、CTAB、EDTA、巯基乙醇购于上海生工生物技术有限公司；DNA Marker由大连宝生物公司提供。Hema-8000型PCR仪（珠海黑马仪器厂）、岛津UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；DYC型电泳仪（北京六一仪器厂）；5810R型冷冻高速离心机（eppendorf）。

　　1.3  DNA提取与检测  采用改良的CTAB法提取基因组DNA［3］。紫外分光光度计检测DNA样品在230，260，280 nm处吸光度；0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA片段大小和完整性，观察并拍照。

　　1.4  PCR扩增和RAPD反应体系的优化  陈大霞等［3］的方法，扩增反应在Hema-8000型PCR仪上进行。在RAPD分析之前，为了确定沉香基因组DNA最佳扩增条件，分别研究了模板DNA浓度、Taq酶用量、dNTPs、引物浓度、Mg2+浓度、退火温度对RAPD反应的影响，采用保持与其他因素一致的条件下，变化单一因素从而筛选最佳浓度，找出适合沉香RAPD反应的最佳反应条件。PCR扩增基本体系为：在20 μl反应体系中，含模板DNA 15 ng、Taq酶1.0 U、dNTPs 0.3 mmol·L-1、随机引物0.2 μmol·L-1、Mg2+ 1.5 mmol·L-1。PCR反应条件：94℃，10 min；94℃，1 min；36℃，1 min；72℃，2 min；45个循环，72℃，8 min。产物进行琼脂糖凝胶电泳。

　　1.5  随机引物的初步筛选  对100个RAPD随机引物(S1～S20，S61～S90，S201～S220，S991～S1020)进行筛选，经过多次重复后能够稳定扩增出清晰的多态谱带，从中筛选3条引物，其序列分别为S62：GTGAGGCGTC；S82：GGCACTGAGG；S90：AGGGCCGTCT，准备用于对沉香RAPD反应体系的优化分析。

　　2  结果

　　2.1  沉香基因组DNA的提取及分析  采用改良的CTAB法提取基因组DNA，经紫外分光光度计检测，其OD260/OD280值在1.86，说明提取的DNA 无蛋白质和RNA污染，OD260/OD230值在2.1，表明所提取的DNA中没有残存的盐类和核苷酸、氨基酸等小分子物质污染。同时将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，显示条带清晰无降解，完整性较好。结果见图1。

　　图1  沉香基因组DNA电泳图（略）     

　　图2  模板DNA用量对扩增结果的影响（引物62）（略）
                         
　　2.2  模板DNA用量  在20 μl反应体系中，本实验设置了5，10，15，20，30 ng 五个梯度进行扩增实验，结果见图2。各梯度范围内都有条带产生，但是在5～15 ng条带数目较少，当用量增加至20～30 ng时，条带数目增加且条带较清晰，因此只要提供足够的PCR扩增所需的模板含量，一般会得到稳定的扩增条带，所以模板用量为20 ng即可达到扩增要求。

　　2.3  Taq酶用量  Taq酶的用量对反应的结果有很大影响。酶量过大，产生非特异性产物，使RAPD稳定性降低；酶量过小，扩增效率低，使RAPD多态性降低［4］。本实验设置了0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 U五个梯度进行扩增实验。结果见图3。当Taq酶的用量为0.25～0.5 U时，扩增条带虽然清晰，但数量较少；在1.0～2.0 U时，扩增的条带清晰，数目增加，在此范围内条带数量没有明显变化，结合扩增效果和实验费用成本，采用1.0 UTaq酶即节约了酶的使用量，又达到了最优反应条件的要求。

　　2.4  dNTPs 浓度  由于dNTPs是RAPD反应的原料，因此，其用量与PCR产物产量直接相关。本实验比较了0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol·L-1五个浓度水平dNTPs用量对扩增结果的影响，结果如图4。其中0.3～0.4 mmol·L-1之间效果最佳，低于或高于此范围扩增条带数量都减少。

　　图3  Taq酶用量对扩增结果的影响(引物82) （略）           

　　图4  dNTPs 浓度对扩增结果的影响  (引物82) （略）
      
　　2.5  Mg2+浓度  Mg2+浓度对扩增的特异性和产量都有影响［5］。实验设置了0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L-1五个浓度水平，由图5可以看出，在0.5～1.0 mmol·L-1浓度范围，扩增出的条带很弱，模糊不清；当Mg2+浓度增加至2.5 mmol·L-1时，虽然个别条带变得清晰，但仍有条带模糊；当浓度在1.5～2.0 mmol·L-1时，可以得到很清晰条带，因此，在此浓度范围较为理想。

　　2.6  随机引物浓度  在优化反应体系过程中设置了0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 μmol·L-1五个浓度水平［6］，引物浓度较低时，扩增条带模糊，强度较弱；当引物浓度在0.8 μmol·L-1时，虽然主条带强度增加，但产生较多非特异性扩增，因此，选用0.6 μmol·L-1浓度扩增出较清晰且稳定的条带。

　　图5  Mg2+浓度对扩增结果的影响  (引物82) （略）         

　　图6  随机引物浓度对扩增 结果的影响 (引物90)（略）
          
　　2.7  不同退火温度  退火温度是影响RAPD 反应灵敏度的最重要条件。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。实验中随机引物的退火温度分别设置为33，34，35，36，37℃。结果见图7。在35～36℃范围内，都能扩增出主要条带，但比较看出，在36℃扩增的条带清晰，而更高于此温度产生的条带较少，低于此温度，则出现较多非特异性条带且主条带模糊不清，因此，选择36℃作为沉香RAPD反应的最适退火温度。

　　图7  退火温度对扩增结果的影响 (引物62)（略）

　　3  讨论
   
　　自RAPD技术诞生至今，已被广泛应用于动植物种类鉴定、基因图谱构建、种群的遗传分析、基因定位、疾病诊断等领域［7］。RAPD技术是由多种成分参加的生化反应，反应中各种成分均为微量，尽管其反应灵敏度高，但是影响因素较多，如不同厂家甚至同一厂家不同批次生产的引物和Taq酶都会引起实验结果的不一致；不同操作者及不同的 PCR仪也会产生结果的差异性，故对实验条件进行摸索和优化十分必要。
   
　　本实验对 RAPD检测技术中的模板DNA用量、 Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量、引物浓度、退火温度等因素进行了反复的实验和摸索，探索出一套适合沉香的RAPD扩增的优化条件，确立了沉香RAPD最佳反应体系：在20 μl反应体系中，模板DNA用量20 ng、Taq酶1.0 U、dNTPs 浓度为0.3～0.4 μmol·L-1、随机引物浓度为0.6 μmol·L-1、Mg2+浓度1.5～2.0 mmol·L-1。PCR反应条件：94℃，10 min；94℃，1 min；36℃，1 min；72℃，2 min；45个循环，72℃，8 min。
   
　　本研究首次对药用植物沉香的RAPD扩增反应体系进行优化，确定了适合于沉香的RAPD扩增反应体系，对进一步进行沉香种质资源和遗传多样性的RAPD分析以及分子标记等方面的研究奠定了基础。

【】
  　　［1］ 国家药典委员会.药典，Ⅰ部［S］.北京：化学出版社，2005：128.

　　［2］ Williams J G K,Kubelic A R, Livak K J,et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Res,1990, 18(22) :6533.

　　［3］ 陈大霞， 李隆云，钱 敏，等.黄连药材DNA提取及RAPD反应体系的优化［J］.中草药，2006，37(8):1233.

　　［4］ 姜自锋，林乃铨，徐 梅.RAPD技术及其应用中的一些问题［J］.福建农林大学学报(版)，2002，31(3):357.

　　［5］ 李 娟，万定荣，陈科力.8种卷柏属药用植物的RAPD分析［J］.中药材，2007，30(4):405.

　　［6］ 严奉坤，许 兴，魏玉清，等.枸杞基因组DNA提取及指纹图谱分析［J］.时珍国医国药，2007，18(1):47.

　　［7］ 郭宝林，戴 波.中药材DNA分子标记研究的技术问题-Ⅱ.RAPD实验技术和方法学论述［J］.中草药，2002，33(2)：179.