不同品种桑叶高效液相指纹图谱的聚类分析

                      作者：游元元 万德光 裴瑾 杨文宇

【摘要】  目的研究四川地区主流桑树品种桑叶的HPLC指纹图谱，并进行聚类分析，探讨品种对桑叶化学成分累积的影响。方法建立桑叶的HPLC指纹图谱，对16批样品共有峰峰面积进行聚类。结果不同品种桑叶相似度均大于0.90，但所含化学成分的含量存在差异，相同基原不同品种的桑叶被聚类到了不同类别中。结论桑叶中化学成分的累积与品种有一定相关性。

【关键词】  桑叶 品种 高效液相指纹图谱 聚类分析

栽桑养蚕有上千年的，每年秋蚕饲养完毕后，桑树所余叶片即可作为桑叶药材被收购使用，所以桑叶的药用是附属于养蚕业的。四川是蚕桑大省，随着蚕桑业的，近年来四川地区培育了众多桑树品种，又从外地引进了不少品种推广种植，故巿售的桑叶药材实际来源于多个品种的桑属植物。尽管大多数桑的栽培品种均源于桑科植物桑Morus alba L.，桑叶来源符合《中国药典》规定［1］，但不同品种的桑叶之间必然存在质量差异。

    本研究选取了目前在四川全省推广栽培的多个主流桑树品种，采用高效液相色谱指纹图谱技术，比较了不同品种冬桑叶的指纹图谱，并进行了聚类分析，以期为探讨品种对桑叶化学成分累积的影响奠定基础，为四川地区桑叶药材的质量评价提供。

    1  仪器与材料

    1.1  仪器DionexP680型高效液相色谱仪(美国戴安公司)，由P680泵、UVD170U紫外检测器、TCC-100柱温箱、ASI-100自动进样器及Chromeleon色谱工作站组成。BP1215天平（德国赛多利斯公司，d＝0.1mg），Rios纯水器（密理博上海贸易有限公司），AS5150BD-I超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

    1.2  试药甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯（AR）；芦丁对照品（批号10080-200306）与绿原酸对照品（批号110753-200413）购自中国药品生物制品检定所。

    1.3  材料桑叶对照药材（批号121123-200302）购自中国药品生物制品检定所，其它样品于2007?11?13从四川省农业院蚕业研究所桑树种质资源圃采集。样品资料见表1。表1  桑叶样品品种

    1.4  数据处理软件  采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》（国家药典委员会）进行HPLC图谱的数据分析；应用SPSS 13.0版进行聚类分析。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件  色谱柱为Phenomenex Luna C18(2) (250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相为甲醇（A）-0.5％磷酸（B）梯度洗脱，甲醇的体积变化：0～10 min为14.5%，10～20 min为14.5%→25.5%，20～28 min为25.5%→32%，28～40 min为32%→38.5%，40～55 min为38.5%→49%；流速1.0 ml·min-1；检测波长320 nm；柱温30℃；进样量15 μl。

    2.2  溶液制备

    2.2.1  对照品溶液制备  精密称取对照品绿原酸5.10mg、芦丁0.85 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

    2.2.2  供试品溶液制备  取样品粉末（过4号筛）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 ml，称重，浸泡过夜，超声提取45 min，称重，补足减失重量。过滤，精密量取续滤液25 ml，减压浓缩至近干，残渣用70%甲醇溶解并定容至5 ml，以0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

    2.3  方法学考察

    2.3.1  精密度实验  取供试品溶液（桐乡青），按已建立的HPLC分析条件连续进样5次，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于1%。仪器精密度良好。

    2.3.2  重复性实验 取同一供试品（新一之濑）5份，按供试品溶液的制备和检测方法进行制备并检测，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于3%，指纹图谱的全貌无明显变化，符合指纹图谱要求。

    2.3.3  稳定性实验  取同一供试品溶液（桐乡青），分别在0，2，4，8，12，24，48 h等不同时间点进样分析，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于3%，表明样品在48 h内是稳定的。

    2.4  不同品种桑叶的HPLC指纹图谱获取 将16个桑叶样品按照所建立的方法进行分析，所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》。以中检所购得的对照药材作为指定参照图谱，经色谱峰匹配，采用中位数法生成对照图谱，通过“相似度”功能进行色谱图谱样本与对照图谱的相似度评价。

    匹配数据显示，所有样品HPLC图谱共有15个共有峰(见图1与图2)。通过与对照品比较，样品中的4号峰与12号峰分别被鉴定为绿原酸与芦丁。在各样品图谱中，4号峰绿原酸的峰面积最大，保留时间适中，且与相邻色谱峰分离良好，故将其指定为内参照峰。

    16批样品相似度为0.915～0.995，相互吻合程度较高，说明样品所含化学成分及相对含量比较一致，但共有峰的总峰面积比（样品共有峰总峰面积/所有批次样品共有峰总峰面积的平均值）显示，不同品种所含化学成分的绝对含量存在差异见图3。
    2.5  不同品种桑叶的HPLC指纹图谱的聚类分析将16个桑叶样品的15个共有峰峰面积作为特征，采用离差平方和法(Ward's method)，以欧氏距离(Euclidean distance)对样品聚类，结果见图4。16个样品聚为4类时，第1类包括S1；第2类包括S2，S3，S5，S6，S10，S12，S14，S16；第3类包括S4，S7，S8，S11，S13；第4类包括S9，S15。

    3  讨论

    供试样品除对照药材外，其它桑叶均在立冬后同时采于四川省农业院蚕业研究所桑树种质资源圃，采收时间、生长环境影响因素相同。

    从聚类结果看，第1类仅有对照药材S1，S1色谱图也显示总峰面积小于其它样品峰面积。分析原因可能为对照药材产地与其它样品不同，存放时间较长，引起化学成分总量的区别。第2类中S2、S3、S14、S16基原为Morus alba Linn.，S12基原为Morus alba var. multicaulis，S5、S6、S10为杂交桑。第3类中S13基原为Morus alba var. multicaulis，S4、S7、S8、S11为杂交桑。第4类中S9、S15基原均为Morus alba var. multicaulis。为更好地满足蚕桑业需要，人们不断地改良桑树品种。在繁育栽培过程中，种质、嫁接方式、树龄等因素都会影响桑叶中化学成分的累积，使同地生长同时采收的相同基原的桑叶被聚类到了不同类别中。

    15个四川地区主流桑树品种中，以湘7920的桑叶所含化学成分总量最多，总峰面积比为1.56；此外嘉陵20号桑叶化学成分总量也较多，总峰面积比为1.14。这两个品种在四川各地良桑推广中占有绝对优势，故四川地区收购的桑叶药材中有相当一部分来自这两个品种，其品质优良。

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  ［1］ 国家药典委员会.药典，Ⅰ部［S］.北京：化学出版社，2005：209.