虫草多糖对小鼠皮肤光老化的保护作用

                    作者：李华 叶杰 李伯勤 应馨萍

【摘要】  目的探讨冬虫夏草多糖对小鼠皮肤光老化的保护作用。方法用8-甲氧补骨脂素（8-MOP）联合UVA制备小鼠皮肤光老化模型，在造模前给皮肤涂抹虫草多糖溶液，造模后24 h内取皮肤组织，进行HE染色和电镜观察并检测组织羟脯氨酸含量。结果光老化组皮肤真皮层明显增厚，炎细胞浸润，皮脂腺不规则增生，纤维组织疏松紊乱，常见断裂，成纤维细胞形态不规则，内质网少，虫草多糖保护组明显改善，羟脯氨酸含量较光老化组明显增加。结论 虫草多糖对皮肤光老化具有保护作用。

【关键词】  虫草多糖 皮肤 光老化

虫草多糖（CP）是虫草的主要活性成分之一，具有抗肝纤维化、抗肿瘤、免疫调节、降血糖等药理作用［1］。近年研究发现虫草多糖对急慢性肾衰有改善作用［2，3］，抗衰老方面的研究相对较少，李连德等［4］采用从虫草深层发酵产物中提取的多糖进行果蝇抗衰老实验，结果表明，不同来源的虫草多糖对果蝇寿命均有不同程度的延长作用，从而证明虫草多糖有延缓衰老的作用；并且延寿的效果随纯度的增大而提高。皮肤是机体最大的器官，皮肤老化是机体衰老的重要组成部分，与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、基底细胞癌、鳞状细胞癌等的发生也有着病因学的关系，而且有损于美容，因此预防和延缓皮肤衰老已成为生命研究的热点之一。皮肤老化包括两个过程，内在老化(intrinsic或chrondogic aging)和光老化(actinic aging或Photoaging)［5］。前者主要受遗传和代谢等因素的影响，可通过改善全身营养代谢平衡等措施加以防护；后者则主要由长期紫外线照射所致，只能通过避免阳光照射和使用防晒药物来预防，而在实际生活中后者是很难避免的。有人用冬虫夏草来抗皮肤衰老，但其是否有效及其作用机制还未见报道。本课题就虫草多糖对皮肤光老化的保护作用进行了实验研究。

    1  材料

    1.1  药物和制剂虫草多糖由中草药冬虫夏草提取，纯度大于95％，由上海中医药大学肝病所提供。组织羟脯氨酸试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。

    1.2  动物昆明种小鼠，雌鼠，体重20～25  g，7～8周龄，由上海中医药大学实验动物中心提供。

    2  方法

    2.1  动物分组及模型制备用电动理发器将小鼠背部皮肤剃净，约2 cm×2 cm，裸露皮肤，随机分3组。第1组为正常对照组，皮肤每天涂抹一次双蒸水，无其他任何处理；第2组为光老化模型组，皮肤每天涂抹1% 8-甲氧补骨脂素（8-MOP）1次，1.5～2 h后，给予190 μw的UVA照射，累积照射138 h（累积强度95 J/cm2），照射结束后24 h内取皮肤；第3组为药物保护组，皮肤每天涂抹浓度为20 mg/ml的虫草多糖溶液，稍干后再涂抹1％8?MOP，1.5～2 h后，给予190 μw的UVA照射，累积照射138 h（累积强度95 J/cm2），照射结束后24 h内取皮肤；3组同时取皮肤组织，固定、HE染色和电镜，并取组织同时进行羟脯氨酸含量测定。

    2.2  标本制备

    2.2.1  HE染色将取下的组织块浸入10％甲醛固定。12 h后，取出固定好的组织块进行蜡块包埋。蜡块切片后，将切片HE常规染色。

    2.2.2  电镜标本制备颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取皮肤组织，约3 mm×3 mm，固定于4％戊二醛磷酸缓冲溶液中，4℃ ，保存1 h，PBS冲洗，1％锇酸，4℃，后固定1 h；PBS冲洗；50％，70％，80％，90％，100％ 乙醇梯度脱水；100％丙酮浸透15～30 min；包埋剂包埋；分别在37，45，60℃ 各24 h聚合；用超薄切片机切成50 nm的超薄切片；醋酸铀和柠檬酸铅双重染色；透射电镜观察照相。

    2.2.3  组织羟脯氨酸含量测定测定方法按照试剂盒操作，同时检测组织蛋白，t检验分析结果。

    3  结果

    3.1  肉眼观察正常对照组，皮肤色泽红润有弹性，光老化组皮肤颜色灰暗，弹性差，局部变硬，毛发脱落，虫草多糖保护组，肉眼看与正常对照无差异。

    3.2  HE染色结果光老化组较正常对照组相比，出现典型的光老化病理变化：表皮厚度不均一，常有脱落，真皮层变厚明显，炎性细胞浸润多见，微血管扩展，毛囊减少，皮脂腺不规则增生。虫草多糖保护组较光老化组，病理变化有明显改善，真皮层较光老化组薄，炎性细胞浸润较少。见图1。

    3.3  电镜结果电镜下观察真皮层的纤维分布和成纤维细胞的形态，结果显示，正常对照组，纤维分布整齐，规则、紧密，无断裂现象，成纤维细胞外形清晰，内质网扩展明显，说明成纤维细胞的蛋白质合成功能旺盛；光老化组，纤维分布疏松，局部出现不规则分布，有断裂现象，成纤维细胞形态变形，外形不规则，细胞质较少，内质网较少，并且有变异的细胞器，说明细胞的蛋白质合成不活跃；虫草多糖保护组，明显改善，纤维排列和成纤维细胞形态及细胞器更接近于对照组。见图2。

    a?对照组  b?光老化组  c?虫草多糖保护组

    图1  实验皮肤HE染色光镜观察图（100×）

    a?对照组  b?光老化组  c?虫草多糖保护组

    图2  电镜下观察各组小鼠皮肤结果（6000×）

    3.4  羟脯氨酸含量的测定取各组皮肤组织测定组织羟脯氨酸含量，平均值，并做各组间的t检验分析。光老化组的羟脯氨酸含量（羟脯氨酸/总蛋白）较对照组明显降低，P＜0.05，虫草多糖保护组的羟脯氨酸含量明显高于光老化组，P＜0.05，虫草保护组与对照组间无明显差异，P＞0.05。结果见表1。表1  组织羟脯氨酸含量测定（羟脯氨酸/总蛋白，±s）%

    4  讨论

    关于动物的光老化模型的建立，刘洪英等［6］用无毛小鼠长期紫外照射建立了光老化模型，其方法是用BALB/c突变无毛小鼠，用UVB和UVA照射皮肤，第1～4周隔日照射，1 h/次；第5～24周每日照射，2 h/次，连续照射24周。UVA辐照强度累积为259.5 J/cm2，UVB辐照强度累积为6.482 J/cm2，无毛小鼠皮肤出现了光老化反应。但是这种方法建立光老化所需时间长，张璃等［7］用应用8?甲氧补骨脂素(8?MOP)/长波紫外线(UVA 320～400 rln1)照射小鼠，快速、简便、可靠地建立了皮肤光老化动物模型，其方法是将甲氧沙林溶液涂抹于小鼠背部皮肤暴露部位，1～2 h后，予小鼠UVA辐射24 h，24 h平均能量为1.1 mW／cm2，累积强度9.5 J/cm2，建立光老化模型。该方法快速造成了光老化，但这种情况在现实生活中比较少见，达不到模拟条件下照射紫外线引起的光老化。本实验是用皮肤每天涂抹1%8?MOP 1次，1.5～2 h后，给予190 μw/cm2的UVA照射，累积照射138 h（累积强度95 J/cm2），建立光老化模型，用较低能量的紫外线长时间照射，更好的模拟了自然情况下的紫外线照射，实验结果显示，光老化组较对照组皮肤颜色灰暗，弹性差；形态学显示真皮层变厚明显，炎性细胞浸润多见，纤维分布疏松，常有断裂现象，成纤维细胞形态变形，外形不规则内质网较少，说明细胞的蛋白质合成不活跃；生化结果也显示组织羟脯氨酸含量较对照明显降低，说明光老化组的胶原含量降低。实验结果表明该方法更好的模拟了自然情况下长期低能量紫外线引起的皮肤光老化。

    本实验主要研究了虫草多糖对皮肤光老化的保护作用，从实验结果可以看出，在制备光老化模型前，预先给皮肤涂抹虫草多糖溶液，再给予同光老化组相同的处理，肉眼观察皮肤的光泽及弹性都较光老化组有明显改善，形态学结果看出，光老化组表皮厚度不均一，真皮层变厚，炎细胞浸润明显，而虫草多糖保护组有明显改善，组织形态接近正常，电镜下观察，光老化组，纤维组织分布变得较对照疏松，常有断裂，成纤维细胞变形，内质网少，而虫草保护组较光老化组有明显改善，并且羟脯氨酸含量测定也显示虫草多糖保护组的胶原蛋白含量较光老化组明显增加，这些实验结果均说明，虫草多糖对皮肤组织的光老化有保护作用。关于虫草多糖能够保护皮肤的光老化的机制方面，目前发现紫外照射可以引起皮肤组织胶原含量的减少，可通过抑制TGF?β信号传导途径实现［8］。有报道，经紫外线照射后，皮肤成纤维细胞TGFβ?Ⅱ受体表达下降，TGF?β/smad信号减弱，从而使Ⅰ型胶原的合成降低［9］。现有研究发现TGF?β/Smad信号在多种组织中都参与了胶原的合成，或者引起了组织的纤维化，研究者也试图从干预该信号途径方面来寻找组织纤维化、皮肤创伤愈合及瘢痕形成［10，11］。在保护皮肤光老化的机制方面，Tanaka H等［12］的研究发现革兰氏阴性厌氧菌Zymomonas mobilis的可发酵代谢物通过提高TGF?β/Smad信号来改善皮肤成纤维细胞的光老化，该代谢物可以抑制UVB照射引起的TβR?II mRNA和蛋白的下降，从而恢复Ⅰ型胶原合成的下降，抑制了光老化。那么虫草多糖保护皮肤的光老化或许也可通过影响TGF?β/Smad信号来实现，有待于今后进一步研究。

【文献】
  ［1］ 郭风彩，陈国民.冬虫夏草多糖的药研究进展［J］.医药卫生，2006，22（7）：999.

［2］ 尹鸿萍，王小波，陈 希.虫草多糖治疗家犬夹闭肾动脉引起的急性肾衰［J］.生物加工过程，2007，5(4)：70.

［3］ 尹鸿萍，王小波，陈 涛. 虫草多糖对腺嘌呤诱发慢性肾衰大鼠的治疗作用［J］.中药新药与临床药理，2007，18(6):451.

［4］ 李连德，樊美珍，李增智.14种虫草多糖对果蝇成虫寿命的影响的试验［J］.微生物学通报，2000，27（6）：428.

［5］ Fisher GJ. The pathophysiology of photoaging of the skin［J］. Cutis. 2005，75(2 Suppl)：5～8，Discussion 8.

［6］ 刘洪英，高仙娥，杨 西，等.无毛小鼠皮肤光老化模型的建立［J］.军事医学院院刊，1999，23（2）：111.

［7］ 张 璃，梁 虹.小白鼠皮肤光老化模型的建立［J］.广东医学，2005，26（12）：1642.

［8］ Rittie L，Fisher GJ. UV-light-induced signal cascades and skin aging［J］. Ageing Res Rev，2002，1(4)：705.

［9］ Quan T，He T，Kang S，et al. Solar ultraviolet irradiation reduces collagen in photoaged human skin by blocking transforming growth factor-beta type II receptor/Smad signaling［J］. Am J Pathol，2004，165(3)：741.

［10］ Christiane A，Amerit M.Resistance of keratinocytes to TGF?-mediated growth restriction and apoptosis induction accelerates re-epithelialization in skin wounds［J］.Journal of Cell Science，2002，115：2189.

［11］ Gu L，Zhu YJ，Yang X，et al. effect of TGF-beta/smad signaling pathway on lung myofibroblast differentiation［J］. Acta pharmacol sin,2007,28(3)：382.

［12］ Tanaka H,Yamaba H,Kosugi N,et al.Fermentable metabolite of Zymomonas mobilis controls collagen reduction in photoaging skin by improving TGF-beta/Smad signaling suppression［J］. Arch Dermatol Res，2007，Epub ahead of print.