新疆天然雪莲与其组织培养物中水溶性多糖的研究

                         作者：刘春兰 杜宁 邓义红 杨林 李阳 

【摘要】  目的对新疆天然雪莲及其组织培养物进行多糖提取分离纯化，为合理利用雪莲提供一定依据。方法雪莲经热水浸提，乙醇沉淀得粗多糖。粗多糖经Sevage法和酶法联合脱蛋白，得初步纯化的新疆天然雪莲多糖（XJXL1）和培养雪莲多糖（PYXL1）。结果纸层析和气相色谱分析表明XJXL1和PYXL1是由多种单糖组成的酸性杂多糖。XJXL1和PYXL1对超氧阴离子自由基和羟自由基具有明显的清除效果，且对细菌有很好的抑制作用。结论从多糖含量、清除自由基及抑菌活性实验可以证明新疆雪莲培养物是新疆天然雪莲的良好替代物，具有进一步开发生产的价值。

【关键词】  雪莲 多糖 自由基 抑菌

雪莲Sausurea involucrate Kar.et Kir.系菊科凤毛菊属的高山草本植物，是我国民族药中有代表性的珍稀名贵药材，系国家3级濒危物种。其化学成分主要有黄酮类化合物、糖类、萜类及其衍生物、甾体成分、木脂素［1］。雪莲花的干燥地上部分入药，可祛风胜湿,通经活络,用于风湿性关节炎、小腹冷痛、月经不调［2］。药理研究表明雪莲花具有抗炎镇痛、抗癌、扩张血管、降血压、清除自由基及抗疲劳等作用。由于雪莲生长环境特异，人工栽培困难，加上雪莲被掠夺性采挖,致使目前雪莲资源匮乏，雪莲物种濒临灭绝。为此应用组织培养技术生产某些重要次生代谢产物的研究越来越受到人们的重视［3］。植物组织培养物是指在无菌和人工控制的营养及环境条件下，研究植物的细胞组织器官以及控制其生长发育的技术［4］。本就是对应用这种技术生产的新疆雪莲组织培养物［5］和新疆天然雪莲进行水溶性多糖提取分析，初步纯化，并进行体外清除自由基及抗菌活性初步比较研究，为进一步探讨雪莲多糖的药理活性，完善雪莲多糖的质量评价体系和合理利用天然雪莲提供依据。

    1  器材与方法

    1.1  材料与仪器新疆天然雪莲Saussurea involucrata Kar.et Kir.（地上部分，由中央民族大学生命与环境学院杨林老师鉴定，购自新疆和静县）；组织培养雪莲由杨林老师提供［5］ 。毛细管气相色谱仪GC-2010型 (日本岛津)；FC-95A馏分自助收集器（上海青浦沪西仪器厂）；722型光栅分光光度计（上海分析仪器总厂）；8002型电热恒温水浴锅（天津市中环实验电炉有限公司）；精密天平，LD4-8型离心机（北京医用离心机）；101-3型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  雪莲粗多糖的提取准确称取干燥的雪莲，加入95％的乙醇回流脱脂后，85℃水浴加热水提乙醇沉淀，95％乙醇、无水乙醇洗沉淀去除单糖，离心，真空干燥后得去除单糖的雪莲多糖粗品。

    1.2.2  雪莲粗多糖的确认及性质

    硫酸-咔唑反应［6］：糖醛酸与咔唑反应，生成紫红色化合物。

    费林试剂反应［7］：还原糖中的还原性醛基可以将费林试剂中的Cu2+还原成Cu+，从而生成红色的沉淀。

    取粗多糖水溶液10 ml，加入过量的费林试剂煮沸2 min，将产生的红色沉淀趁热除去，滤液加入硫酸酸化，加热煮沸10 min后用10%氢氧化钠中和，再加入一定量费林试剂，加热煮沸，观察是否有砖红色沉淀。

    碘-碘化钾反应［8］：淀粉遇碘具有一种特征蓝色。取粗多糖水溶液10 ml，加入碘化钾-碘试剂，观察溶液是否变蓝。

    Molish反应［8］：五碳糖类以及它们的双糖类均能被硫酸分解成糠醛，六碳糖类以及它们的双糖类同样地被分解成羟甲基糠醛。这些糠醛类化合物与a-奈酚作用产生有色缩合产物。

    苯酚-硫酸反应［8］：五碳糖类以及它们的双糖类均能被硫酸分解成糠醛，六碳糖类以及它们的双糖类同样地被分解成羟甲基糠醛。这些糠醛类化合物与苯酚作用产生橘红色缩合产物。

    1.2.3  雪莲粗多糖蛋白质、糖含量及半乳糖醛酸含量测定蛋白质含量测定采用凯氏定氮法检测［9］；总糖含量采用苯酚-硫酸法检测［10］；糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法检测［11］。

    1.2.4  雪莲粗多糖的初步纯化及组成分析

    粗多糖的初步纯化:将粗多糖配成2%溶液，链酶蛋白酶与Sevage法联合脱蛋白，重复3次［12］。

    纸层析法［13］：取10 mg多糖，完全酸水解，以BaCO3 中和，沉淀过滤后将溶液浓缩至1 ml，点样于新华1号中速滤纸（15 cm×40 cm），展开剂为正丁醇∶乙酸∶水（4∶1∶5）。室温展层30 h后取出，吹干后喷显色剂。

    气相色谱法［14］：取10 mg多糖，甲醇解，硅烷化上样。OV210型毛细管柱（30 mm×0.32 mm×0.25 μm），氢气为载气 ，流速为1.5 ml/s。柱温为100 ℃→250 ℃，程序升温（5 ℃/min），FID检测器。

    1.2.5  雪莲多糖清除自由基活性测定雪莲多糖清除·OH的测定［15～16］：清除率（%）＝(A0－A样品)/A0×100％

    雪莲多糖清除O-2·的测定［17］：清除率（%）＝(A0－A样品)/A0 ×100％

    雪莲多糖清除R·的测定［18］：清除率（%）＝(A0－A样品)/A0 ×100％

    A0—试剂空白吸光度；

    A样品—样品吸光度。

    1.2.6  雪莲多糖抑菌活性研究

    最低抑菌浓度试验［19］：①细菌：以紫外分光光度计在波长为550 nm处测定的细菌培养液的OD值表示，培养液OD值与培养液内细菌繁殖速度呈正相关，OD值升高越快，表示培养液内细菌繁殖速度越快。在培养液中加入雪莲提取物,可延缓其OD值上升。若其吸光度与空白对照组一致，表明该培养液中完全没有细菌的生长繁殖，则该样液浓度即为雪莲提取液的最低抑菌浓度。②霉菌：用目视观察法确定最低抑菌浓度。

    抑菌活性研究方法：采用原形纸片法［20,21］。分别刮取供试菌（5种）菌苔于5 ml无菌水中，振荡摇匀得菌悬液，倒入溶化并冷却至40～45℃的相应培养基中，摇匀后，迅速分装于培养皿中，待凝固后，取已消毒过的圆形滤纸蘸取多糖溶液，略干后贴于培养基平板上，同时做一溶剂空白对照。置恒温培养箱中培养（细菌36～37℃，18～24 h；真菌28～30℃，48～72 h）后分别观察结果，测量抑菌圈宽度的大小。以上步骤均为无菌操作，每个样品设2平行样，结果求平均值。

    2  结果

    2.1  雪莲水溶性多糖的提取及理化性质将干燥的雪莲用95%乙醇回流脱脂，热水提取乙醇沉淀，常规干燥，得雪莲粗多糖，提取率分别为：新疆天然雪莲粗多糖(XJXL) 15.9%，培养雪莲粗多糖(PYXL) 7.1%。两种雪莲粗多糖均为灰褐色粉末状固体，无味，溶于水，不溶于乙醇，乙醚，丙酮，氯仿等有机溶剂。

    Molish反应与α-奈酚作用产生有色缩合产物，苯酚-硫酸反应产生橘红色缩合产物。说明所提物质为多糖类。硫酸-咔唑反应生成紫红色化合物，可以鉴别雪莲水溶性粗多糖含有糖醛酸。费林试剂反应生成红色的沉淀，说明雪莲水溶性粗多糖含有还原性糖。碘-碘化钾实验无蓝色出现，说明两种雪莲水溶性粗多糖不含有淀粉。

    雪莲粗多糖经凯氏定氮，苯酚-硫酸，硫酸-咔唑法测得蛋白质、糖含量及半乳糖醛酸含量结果见表1。表明二者均为酸性杂多糖。

    2.2  雪莲粗多糖的纯化及组成分析两种雪莲粗多糖经链酶蛋白酶与Sevage法联合脱蛋白后，得初步纯化多糖XJXL1和PYXL1。由PC、GC分析，XJXL1和PYXL1的单糖组成及含量比结果见表2，图1～2。表明XJXL1和PYXL1的单糖组成基本相同，但含量有差别，其中GalA的含量XJXL1是PYXL1的2.7倍，XJXL1和PYXL1均是由多种单糖构成的杂多糖。

    2.3  雪莲多糖清除自由基活性测定本实验模拟产生·OH，O-2·和R·的3个体系，浓度远大于体内该两种自由基浓度［22］，在产生·OH，O2ˉ·和R·的3个体系中加入浓度不同的XJXL1和PYXL1，实验结果见图3～4及表3。

    表1  雪莲粗多糖的蛋白质、糖含量、半乳糖醛酸含量表2  雪莲多糖的单糖组成及单糖组成比例

    从图3可看出,当糖浓度达0.5 mg/ml时，XJXL1和PYXL1清除·OH效果较好；随多糖浓度成正相关性；相同浓度多糖清除·OH作用差别不大；当浓度达1.5mg/ml时，PYXL1和XJXL1清除·OH效果相同，当浓度达2.0 mg/ml时，PYXL1和XJXL1清除·OH均达到近60％。体外实验表明，PYXL1和XJXL1均为良好的·OH自由基清除剂。

    从图4可看出：当糖浓度达0.03 mg/ml时，XJXL1和PYXL1清除O2-·效果很好；随多糖浓度成正相关性；在浓度达0.1 mg/ml前，相同浓度XJXL1和PYXL1多糖清除O2-·作用大小为XJXL1>PYXL1，XJXL1清除率是PYXL1约1.4～2倍；但当浓度达0.1 mg/ml时，PYXL1和XJXL1清除O2-·效果相同，PYXL1和XJXL1清除O-2·达到近70％。体外实验表明，PYXL1和XJXL1均为良好的O2-·自由基清除剂。

    比较图3～4可以看出，尽管PYXL1的提取率不及XJXL1，但是从清除率这点可以得出结论：雪莲组织培养物提取的水溶性多糖是野生雪莲提取的水溶性多糖的优良替代品。

    从表3可看出，随糖浓度增高时，XJXL1和PYXL1清除R·效率成负增加趋势。这可能由于在有自由基引发剂存在的条件下，与单糖一样，多糖也可以自动氧化，产生新的有机自由基，使多糖在产生R·的体系，本身产生的有机自由基与它清除的R·得到平衡，而在低浓度下，减少了多糖分子与自由基引发剂的反应概率，表现出多糖的抗氧化作用。 表3  不同浓度的XJXL 和PYXL对R·的清除率

    2.4  雪莲水溶性多糖的抗菌活性测定

    2.4.1  最低抑菌浓度确定结果见表4。

    表4  最低抑菌浓度确定结果

    雪莲多糖细菌E.cS.aB.s真菌A.nP.cXJXL1356--PYXL1456--

    “-”表示为检测到最低抑菌浓度

    根据表4，为了对多糖抗菌活性进行比较，选择多糖浓度为7.5mg/ml最低抗细菌测试浓度。真菌无最低浓度，故认为XJXL1及PYXL1对真菌无抑制作用。

    2.4.2  多糖抗菌活性结果见表5。从表5中可知，XJXL1及PYXL1对E.c，S.a，B.s均有一定作用，且XJXL1及PYXL1对细菌E.c，S.a，B.s的作用在相同糖浓度下，作用效果变化不特别明显。比较可以看出，尽管PYXL1的提取率不及XJXL1，但是从抗菌活性这点就可以把雪莲组织培养物提取的水溶性多糖替代野生雪莲提取的水溶性多糖。表5  多糖XJXL1和PYXL1抗菌活性

    3  结论

    本实验通过对新疆雪莲多糖及其组织培养物进行水溶性多糖的提取，进一步分离纯化得多糖XJXL1及PYXL1；PC、GC分析，XJXL1及PYXL1单糖组成基本相同。对XJXL1及PYXL1进行抗菌实验及清除自由基活性研究。抗菌实验表明XJXL1及PYXL1对细菌有作用，对真菌无作用。清除自由基活性实验模拟产生·OH ，O-2·和R·的的3个体系，其浓度远大于体内这3种自由基的浓度［18］。结果发现，XJXL1及PYXL1对O2-·和·OH都具有明显的清除作用，而且在实验模拟的浓度范围内与浓度成正相关；但对R·几乎无清除效果。表明XJXL1及PYXL1是一种清除自由基良好的抗氧化剂。氧自由基与机体衰老有很密切的关系，推测新XJXL1及PYXL1可作为抗衰老保健或药物在临床上使用，但还有待于体内实验进一步证实。

    从多糖提取率来看，新疆雪莲组织培养物不及新疆天然雪莲，但从糖含量、清除自由基及抗菌活性研究中可以证明组织培养新疆雪莲可作为新疆天然雪莲的良好替代物以解决新疆天然雪莲资源短缺的问题，具有进一步研究开发的价值。

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