四川椭圆叶花锚愈伤组织的诱导

                 作者：覃筱燕，杨林，邵丽勉，刘盛林  

【摘要】  　　目的探讨不同培养条件及不同的外殖体对椭圆叶花锚愈伤组织诱导的影响。方法以椭圆叶花锚种子培养的无菌苗的茎和新鲜植株的茎段为外殖体，MS为基本培养基，分别以6-BA和NAA两种植物激素为变量进行实验研究。结果MS培养基+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA对诱导椭圆叶花锚愈伤组织的形成效果最佳；高浓度的6-BA配合较高浓度的NAA诱导的愈伤组织致密，出愈率高。结论不同培养条件对椭圆叶花锚愈伤组织的诱导有不同的影响，其中以无菌苗的茎段为外殖体易形成愈伤组织。

【关键词】  外殖体； 愈伤组织； 椭圆叶花锚

　　Abstract：Objective To research the effects of different culture and different exophyte on the callus of Halenia elliptica D. Don.MethodsWith the stem of sterile seedling and fresh plants as exophyte, MS as a basic medium, 6-BA and NAA hormone were adopted as the experimental variables.ResultsMS +1.0 mg / L 6-BA +1.0 mg / L NAA induced the best effect of callus; higher concentrations of 6-BA with high concentrations of NAA made callus densification and higher rate.Conclusion Different plant hormones and their different concentration ratios have different effects on the callus of Halenia elliptica D. Don and adventitious buds.

　　Key wordsExophtye;   Callus;   Halenia elliptica D. Don
   
　　椭圆叶花锚，又名黑及草，藏语称“去合斗拉果玛”，蒙名为希赫日-地格达，是一年生或两年生草本植物，为龙胆科(Gentianaceae)花锚属(Halenia Borkh)植物，主要分布于我国的西藏、青海、四川、甘肃等地，生于海拔2 500～4 400 m的林下或草原［1～3］。椭圆叶花锚性味苦寒，全草入药，为藏蒙药系统中肝胆系统疾病的常用药物。医学验证其对治疗肝炎有显著疗效［4～8］。以花锚为主药材研制、开发的治疗肝胆系统疾病的成品藏药，具有疗效稳定、有效率高等特点，市场前景广阔。随着我国藏药事业的迅速，椭圆叶花锚的药用资源需求量快速增加。由于过度采挖，导致其野生植物资源日益枯竭。为了该药物资源的可持续利用，我们实验室进行了椭圆叶花锚的组织培养技术实验，探讨不同植物生长激素对于椭圆叶花锚愈伤组织的诱导和芽长势的影响，找出适宜于实验室植株再生的培养条件，为大田实验提供优质种苗，从而为椭圆叶花锚规模化生产提供新途径。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　实验材料椭圆叶花锚的种子和新鲜植株（见图1，鉴定人：西昌学院 刘建林副教授）采自四川省美姑县大风顶保护区，海拔在3  500 m左右。

　　1.2  材料的处理

　　挑选颗粒饱满的椭圆叶花锚种子，低温层级处理7 d 后用温水（﹤15℃）浸泡30 min，12%双氧水（H2O2）消毒8 min，无菌水冲洗3次后，放置于超净台上待用。

　　1.3 无菌苗的获得

　　在无菌条件下，将已表面消毒后种子接种于无激素的MS培养基上，7～10 d后，种子萌发，待其长到5～6 cm，将无菌苗(图2)的根和茎分别剪（或切）成1 cm左右的块段，待用。

　　1.4  新鲜植株的处理

　　将野生的椭圆叶花锚植株洗净并将老叶去掉，剪（或切）成1 cm左右的带有腋芽的茎段和洗净的根段，在超净台上先将其用75% 的酒精灭菌30 s然后再用0.1%升汞灭菌10 min，最后用无菌水冲洗3～5遍,放置待用。

　　1.5  愈伤组织的诱导将无菌苗的根、茎块段和新鲜植株带有腋芽的茎段和洗净的根段在无菌的条件下以适当深度放入不同的培养基中，每瓶2～3块。放置于恒温培养箱中，培养温度为（20～25）℃，光照时间12 h·d-1。光照强度为35 ～ 40 μmol·m-2·s-1。

　　1.6  培养基的配制以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，配制成8种培养基。将培养基的 pH值调至5.8左右,高压灭菌20 min后装入150 ml的锥形瓶中，每瓶约30 ml。

　　1.7  统计方法

　　形成愈伤组织的外植体上指形成了肉眼可见的愈伤组织的外植体，愈伤组织形成频率(%)＝形成愈伤组织的外植体/接种的未污染的外植体数100%，所有数据均于外植体接种1个月后统计。

　　2  结果

　　2.1  不同外植体对椭圆叶花锚愈伤组织形成的影响

　　2.1.1  不同来源的外植体不同来源的外植体在相同的实验条件下，对愈伤组织形成有不同的影响。实验中发现以新鲜植株带有腋芽的块段和洗净的根为外植体没有形成愈伤组织，分析其主要原因可能为新鲜的植株虽然具有活着的组织，但其再分化能力较弱，不易形成愈伤组织。以无菌苗的根、茎块段为外植体在相同的实验条件下易形成愈伤组织，分析其主要原因可能为无菌苗是新长成的幼苗具有较强的再分化能力，易形成愈伤组织。

　　2.1.2  同一来源不同部位的外植体实验中发现以无菌幼苗的茎段和根段作为外植体对愈伤组织形成有不同的影响。以茎段为外殖体形成的愈上组织多为淡黄绿色（见图3），长势也较好。以根段为外殖体形成的愈伤组织多为淡白色，生长较慢，易水渍化，并且对激素较茎段敏感。见图4。

　　2.2  不同激素水平对椭圆叶花锚愈伤组织形成的影响 椭圆叶花锚的愈伤组织多呈致密的团块，淡黄绿色，有的也成灰白色或淡黄色的疏松水渍化且易褐化。不同浓度配比的6-BA和NAA的14种培养基中，以MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA诱导愈伤组织的效果最好，出愈率为93%。呈淡黄绿色的愈伤组织培养14 d后，茎段切口处变粗、膨大，逐渐形成紧密的黄绿色的愈伤组织（见图3），且不易褐化。结果见表1。从表1中可以看出，当6-BA浓度不变时，随着NAA浓度的升高，愈伤组织发生频率增加。当NAA浓度不变时，随着6-BA的浓度的增加，愈伤组织发生频率增加。当培养基中只有6-BA是不产生愈伤组织。当培养基中只有NAA时，能产生愈伤组织,但其容易形成不定根（见图4）。表1  不同植物激素水平对椭圆叶花锚愈伤组织形成的影响（略）

　　2.3  培养箱湿度和温度对椭圆叶花锚愈伤组织形成的影响在实验中观察发现，培养箱的湿度对愈伤组织的形成有一定影响。适宜湿度在30%左右，湿度过高容易引起霉变和褐化，湿度低则易引起愈伤组织缺水死亡。培养箱的温度适宜在20～25℃，温度过高易引起褐变，温度低则易造成愈伤组织生长缓慢。分析其原因可能与其生长的环境有关。椭圆叶花锚是生长在四川海拔较高的山上，其生长环境空气湿度较大，因此在实验过程中应保证培养箱中的湿度恒定。

　　3  讨论

    花锚属植物是藏蒙药中肝炎类疾病的常用药物，全草入药，具有重要的药用价值。该属植物的主要有效成分为（口山）酮及（口山）酮苷、裂环烯醚萜类、三萜类化合物及其它黄酮苷等，具有抗肝炎、抗氧化活性和降血糖等功效［4～8］。在我国,该属植物药用较长，故具有很高的药理研究价值，特别是有关抗肝炎方面的研究显示出较大的市场潜力，值得进一步深入研究；但是这种药物资源一般生长在人迹罕至的高寒缺氧环境中，其再生周期较长甚至不能再生，因此供需矛盾也由此变得越来越突出。由于对野生植物的过度采挖造成资源匮乏，采用人工的方法达到该药物资源的可持续利用也已成为目前及今后对该属植物重点研究的目标。

    目前该属植物的人工引种栽培技术在一定程度上已经可行，但是，还需要通过多种途径来提高对其的培育效率［9～11］。而我们实验室关于花锚属植物的组织培养技术的成功，弥补了花锚属植物的组织培养技术的空缺，它将为该属植物实现高原地区中藏药资源可持续利用提供主要途径之一。

    本实验以来源于四川省美姑县大风顶保护区，海拔在3 500 m左右的椭圆叶花锚种子和新鲜植株，切取由种子诱导的无菌幼苗的茎段和新鲜植株（为野生植株）的带腋芽的茎段作外殖体，MS为基本培养基，分别以6-BA和NAA两种植物激素为变量进行椭圆叶花锚愈伤组织的形成效果最佳；高浓度的6-BA配合较高浓度的NAA诱导的愈伤组织致密，出愈率高，从而出不同培养条件对椭圆叶花锚愈伤组织的诱导有不同的影响，其中以无菌苗的茎段为外殖体易形成愈伤组织。

【】
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