复方鳖甲软肝方防治肺纤维化细胞凋亡的实验研究
作者：段斐，耿德海，许文杰，唐志远，史建红
【摘要】 目的通过观察细胞凋亡，探讨复方鳖甲软肝方防治肺纤维化的机理和疗效。方法选SD雄性大鼠180只，随机分为假手术组，模型组，阳性药物对照组，复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组，共6组，每组30只。博莱霉素常规造模的同时给药，假手术组和模型组每天灌胃生理盐水，其余4组灌药进行防治。各组分别于7，14，28 d随机抽取10只大鼠，8只制成光镜标本，2只麻醉后快速开胸取肺组织，进行电镜标本的制作。免疫组化载玻片用DEPC处理后备用。结果Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞以及成纤维细胞均有凋亡。bax在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞，肺泡巨嗜细胞胞质和胞膜均表达。假手术组和高、中剂量组呈弱阳性表达，模型组强阳性表达。Bcl-2在核膜和线粒体表达，模型组强阳性表达，药物组弱表达。结论复方鳖甲软肝方通过调节细胞凋亡，上调Bax活性，抑制Bcl-2的活性，抑制Ⅱ型上皮细胞凋亡，减少纤维积聚和纤维化形成，对肺纤维化起到防治作用。
【关键词】 复方鳖甲软肝方；凋亡；超微结构
Abstract:ObjectiveTo study the preventive and therapeutic effect of compound prescription with turtle shell (CPTS) on rats with IPF (Idiopathic pulmonary interstitial fibrosis) caused by Bleomycin A5.Methods180 SD rats were randomly divided into six groups:sham operation group,model group,positive medicine group, high-dosage group, medium-dosage group and low-medium group.After they were given the medicine, ten rats in each group each time were killed respectively on the 7th,14th and 28th day. 8 of them were made for light microscope specimen. 2 rats were operated to open thorax and get lung tissue speedily. Immunohistochemical glass covers were dealt with DEPC for use.ResultsAT Ⅰ, ATⅡ and fibroblast all showed apoptosis, Bax expression in AT Ⅰ,ATⅡ and alveolus macrophage cytoplasm,cytolemma expression was less positive in sham operation group,high CPTS and medium CPTS groups and remarkably positive in model group,which showed CPTS could restrain apoptosis of AT and macrophage.Bcl-2 was expressed in chondriosome and on karyotheca. Expression in model group was less positive and remarkably positive in CPTS groups,which showed CPTS could restrain formation of IPF.ConclusionCPTS has obvious treating effect through reducing fiber piling and restraining forming of fibrosis on rats with IPF caused by Bleomycin A5, CPTS can regulate the alveolar apoptosis by inhibiting the Bcl-2 expression, enhancing the Bax expression and inhibiting the apoptosis of ATⅡ .
Key words:Compound prescription with turle shell; Apoptotic; Supermicro structure
特发性肺间质纤维化以肺泡上皮细胞凋亡（apoptosis）导致肺泡结构完整性破坏和肺成纤维细胞增生为特征［1］。早期各种炎症细胞和肺泡细胞分泌炎症因子引起细胞损伤与细胞增殖失控，启动细胞凋亡的途径，引起肺纤维化［2］。Bcl-2和Bax是一对相互拮抗的基因产物，两者自可形成同二聚体，也可相互作用为异二聚体。Bcl-2和Bax与凋亡调控直接相关：Bax增高促进细胞凋亡；Bcl-2增高抑制细胞凋亡［3］。两者的平衡状态维持肺组织细胞的正常，保持呼吸功能的稳定。
1 器材
1.1 药物防治药物：复方鳖甲软肝方(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产的复方中药干粉，600 g/瓶，批号：20020501)，高剂量1.4 g·kg-1·d-1、中剂量0.7 g·kg-1·d-1、低剂量药物为0.35 g·kg-1·d-1，相当于临床日用量（0.1 g·kg-1）的14倍，7倍，3.5倍。
阳性对照药：醋酸强的松0.56 mg·100 g-1·d-1，广东华南制药厂生产，批号011201。
造模药物：注射用盐酸博莱霉素(bleomycin，BLM-A5 )，日本化药株式会社生产，批号X12100。
1.2 动物及分组SD大鼠180只，雄性，体重200～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物级别：SPF/VAF，许可证编号：SCXK2002-0003。饲养于同级动物房，自由饮水。购入后适应性饲养1周，进行实验分组。动物随机分为6组：假手术组；模型组；阳性药物对照组；复方鳖甲软肝方（以下表格中简称鳖甲方组）高、中、低剂量组。每组30只。各组均于7，14，28 d随机抽取10只大鼠采血，同时取肺制成光、电镜标本。
1.3 试剂凋亡试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司分装的Sigma公司试剂。SP-9002，ZLI-9017DAB，SC-7480 Mouse anti-Bax， SC-1666 Mouse anti-PAR4 SC-7382 Mouse anti-BCL-2。
1.4 仪器
石蜡切片机，莱卡2016、包埋机，KD-BM。低温冰箱MDFU5410(-60℃)成都泰盟科技有限公司，数码显微照相机Nikon Coolpi×4500。
2 方法
2.1 大鼠肺纤维化模型制备用1.5%戊巴比妥钠（0.1 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台上，颈部剪去毛、常规碘酒与酒精消毒，切开颈正中皮肤，逐层分离，暴露气管，然后用一次性1 ml注射器向气管内注入0.3 ml博莱霉素生理盐水溶液（5 ml·kg-1），然后立即将动物直立并旋转，使药液在肺内均匀分布。假手术组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。
2.2 取材和切片制备
2.2.1 各组光镜取材常规取材。事先用APES处理切片，37℃ 24～48 h温箱干燥备用。石蜡切片，厚度为5 μm。脱蜡后组织片裱于APES处理后的载玻片上（免疫组化染色），入37℃温箱干燥48 h备用。
2.2.2 各组电镜取材常规普通电镜取材。
2.3 免疫组化操作步骤（Bcl-2，Bax）将切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脱蜡15 min→100%酒精Ⅰ15 min，100%酒精Ⅱ15 min，95%酒精10 min→90%酒精10 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸馏水冲洗→0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育20 min→蒸馏水洗两次，2 min/次 ，PBS洗5 min→0.1mol/L枸橼酸缓冲液内微波炉抗原修复（温度98～100℃）20 min→室温冷却后加10%山羊血清，37℃湿盒内室温孵育30 min→倾去血清，不洗，加一抗，鼠抗PARP(1∶100),鼠抗Bax和Bcl-2（1∶100），湿盒内4℃过夜。取出湿盒室温放置30 min，37℃放置1 h→0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次→湿盒内滴加生物素化二抗（抗鼠1∶100）→0.01mol/L PBS洗3次，5 min/次→滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，湿盒内37℃孵育30 min→0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次→DAB显色（1 ml蒸馏水中加入DAB、缓冲液及H2O2各一滴，混匀），显微镜下控制显色程度→水充分冲洗以中止显色→梯度酒精脱水：70%酒精30Sec，80%酒精1 min，90%酒精5 min，95%酒精10 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各30 min，二甲苯各透明20 min→中性塑胶封固→阴性对照用0.01 mol/L PBS 代替一抗，其余步骤同上。
2.4 结果
判定在用DAB显色的免疫细胞化学切片上，阳性反应按颜色深浅分为：棕黄色为强阳性；黄色为阳性；浅黄色为弱阳性；与间质颜色一致者为阴性。
3 结果
3.1 电镜下细胞凋亡结果电镜下可见Ⅱ型细胞核膜表面凹凸不平，染色体边集，密度增强，固缩现象明显。胞质内凋亡小体中可见膜包裹完整的细胞核碎片。Ⅰ型细胞细胞器和胞质浓缩，细胞膜破坏，核染色质的凝集边界不清。
3.2 Bax和Bcl-2在肺组织中表达免疫组化结果
3.2.1 Bcl-2在肺组织中免疫组化结果7 d时Bcl-2在假手术组肺组织中细胞质、细胞核中均无表达，只在肺间隔Ⅱ型细胞的核膜部分表达；复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组在肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞部分细胞质呈浅黄染色，呈现阳性表达，偶见肺巨噬细胞核着色（棕色）呈强阳性表达。假手术组在28 d时仍然呈肺间隔Ⅱ型细胞的核膜部分表达，其意义有待进一步探讨。模型组肺泡间隔细胞及巨嗜细胞胞质内见分布均匀的棕色颗粒，明显多于假手术组和药物组。且绝大多数已进入胞核，而复方组的Bcl-2的阳性表达则偏重于胞质。
3.2.2 Bax在肺组织中免疫组化结果实验结果表明，Bax在肺组织中主要在肺泡Ⅰ型、部分Ⅱ型细胞和肺泡腔炎症细胞的胞质部位呈阳性表达，部分在肺泡隔间质细胞表达。7 d时假手术组和高、中剂量药物组在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型细胞、肺泡炎症细胞和部分间质细胞的胞质中呈阳性表达，尤其Ⅰ型细胞中表达较多，部分间质细胞的胞核也有表达。在模型组、阳性药物组、低剂量组在肺间隔肺泡Ⅰ型细胞有部分表达，在巨噬细胞胞浆呈阳性表达结果。14 d假手术组和高、中、低剂量组在肺泡间隔细胞质均呈现弱阳性表达。阳性药物组和模型组表达较弱。28 d假手术组和高、中、低剂量组肺泡间隔表达较好，呈阳性，但不如7 d表达明显。肺泡Ⅰ型上皮细胞也有部分表达。
4 讨论
BLM通过损伤肺部基膜，使上皮与间质细胞得以持续性接触从而激活上皮细胞和成纤维细胞，产生过量胶原,形成不可逆肺纤维化。复方鳖甲软肝方可以防止细胞脱落，特别是小剂量组效果最好。是否中药在某些情况下药量过大可以对机体产生毒副作用值得探讨。
最近研究结果显示［1～3］，肺泡上皮细胞凋亡在肺纤维化的发生与中可能起非常重要的作用。肌成纤维细胞在致炎因子的作用下，诱导上皮细胞的凋亡引发纤维化，这一点在体内外实验中均得到证实。凋亡的上皮细胞主要在肌成纤维细胞的基本病灶周围促使纤维灶的生成。另外在增生的上皮细胞中发现肿瘤抑制蛋白p53和p21表达上调，这可能导致细胞凋亡。众所周知：在IPF的形成过程中由于炎症的刺激，肺泡上皮细胞和各种炎症细胞都分泌细胞因子，细胞因子以各种形式或促进、或抑制调节各种细胞的凋亡。各种细胞都存在凋亡的状态，通过凋亡的形式调节肺泡的稳定状态。在实验中我们从电镜照片中可以看到肺Ⅰ型和Ⅱ型细胞凋亡，以及成纤维细胞均有明显的凋亡。说明这些细胞参与IPF的形成和防治过程。细胞中Bcl-2主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体内膜上，与膜的结合对于其发挥功能是极其重要的［4］。实验表明，失去膜定位能力的Bcl-2蛋白抗凋亡能力减弱了许多。从实验中发现，Bcl-2在假手术组，7，14，28 d仅在肺组织中Ⅱ型细胞核膜中有表达，以7，28 d结果明显；细胞内线粒体则无表达，其意义有待进一步探讨。药物高、中、低剂量组呈现阳性或弱表达，模型组呈阳性或强阳性表达，说明复方鳖甲软肝方对Bcl-2蛋白的调亡有抑制作用，通过抑制凋亡来减缓胶原的形成。有报道说：肝的炎症早期，Bcl-2呈高表达，后期纤维化以后呈现低表达。同肺的假手术组一直仅在Ⅱ型细胞核膜表达相比有些不同，该种结果是否与不同脏器有关，还是有其他未知的影响因素［4,5］，有待进一步考证。但正是同一种凋亡蛋白无论通过何种途径在不同器官同时表达，证明其结构基础有相通性，从而支持了我们异病同治的理论。而同一种蛋白在不同器官有不同的表现形式，又表达了各个器官之间的差异性。
报道Bax主要在细胞质和细胞膜上表达［4］，但在7 d复方鳖甲软肝方各组均呈阳性表达，高剂量组呈强阳性，并且在细胞间质细胞的细胞核上的也有部分表达，其原因还有待进一步探讨。28 d 阳性药物组Bax却有极少的表达；假手术组和复方鳖甲软肝方高剂量组Bax在肺部的细支气管上皮细胞和肺间质细胞呈现阳性表达。14 d中间期相对较低，呈现弱阳性表达。表现为一种波浪型，同文献报道不一致［5,6］，其原因有待进一步探讨。
总之，复方鳖甲软肝方通过调节细胞中Bax和Bcl-2的凋亡蛋白表达，抑制成纤维细胞增生，抑制细胞因子，调节AT-II的凋亡，保持上皮细胞完整性，从而达到抗纤维化的作用。但两者在肺中相互作用的关系，我们将在后期实验中探讨。
【文献】
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