半边旗中黄酮的提取工艺研究

                         作者：吕应年 邓亦峰， 梁念慈

【摘要】  　　目的确定提取半边旗总黄酮的最佳工艺条件，并精制以提高黄酮的含量。方法采用正交实验法，考察溶剂用量、乙醇浓度、提取时间以及提取次数对半边旗中总黄酮溶出量的影响，确定最佳提取条件，然后对半边旗总黄酮进行精制，用高效液相色谱测定已知黄酮的含量。结果在所考察的因素中，对半边旗总黄酮提取影响程度为乙醇浓度>提取次数>溶剂用量>提取时间，半边旗总黄酮最佳提取条件为12倍用量80%乙醇回流提取2次、每次回流2 h，精制后半边旗黄酮含量达到84.3%以上。结论 该工艺设计合理，操作简单，生产成本低廉，有较高的生产应用价值。

【关键词】  半边旗 黄酮 正交实验 精制

　　Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction conditions for flavonoids from Pteris semipinnata L., and refine the flavonoids to improve the purity.  MethodsOptimized conditions including ethanol quantity, ethanol concentration , reflux duration and extraction times were determined by the orthogonal test. The flavonoids were refined with different solutions and the purity was determined by HPLC. ResultsThe order of factors to affect the flavonoid extraction was ethanol concentration > extraction times > ethanol quantity > reflux duration. The best extraction technology was that 12-fold and 80% ethanol, refluxing for 2 hour at water bath and 2 times of extraction. The purity of refined flavonoids was up to 84.3%. ConclusionThis technology is simple,reasonable and the cost is lower, which is suitable for industralization.

　　Key words：Pteris semipinnata L.;  Flavonoids;  Orthogonal test;   Refine

　　半边旗Pteris semipinnata L.，又名半边蕨、半边莲、单边旗，系凤尾蕨科植物，是一种南方常用草药，始载于《岭南采药录》，称半边旗。该植物有止血、生肌、解毒、消肿之功效，民间用于吐血、外伤出血、发背、疔疮、跌打损伤、目赤肿痛等［1］。研究表明，半边旗中含有挥发油、萜类、黄酮、皂苷等多种物质［2］。有关半边旗的药效成分研究主要集中在萜类化合物［3,4］，半边旗中黄酮类物质的研究报道较少。
　　黄酮类化合物是中草药中一类重要的药效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等广泛的生物活性，天然黄酮主要以游离的苷元或与糖结合成糖苷的形式存在于植物中。本研究采用正交实验法考察溶剂用量、乙醇浓度、提取次数、提取时间对半边旗总黄酮溶出量的影响，以确定最佳提取条件，并研究了半边旗黄酮的精制方法，为合理开发利用半边旗资源提供依据。

　　1  器材

　　岛津LC-10A高效液相色谱仪(LC-10ATVP泵，SCL-10AVP控制器，SPD-10AVP紫外检测器，CTO-10AVP柱温箱)；紫外分光光度计(岛津UV3101PC)；分析天平（Mettler, AE240）；旋转蒸发仪（上海申越仪器公司）；四用紫外分析仪（上海顾村科学器材厂）。芹菜素和木犀草素标准品购于天津尖峰植物提取物公司，甲醇为色谱纯（TEDIA Company Inc. USA），提取及精制用乙醇、氯仿、醋酸乙酯均为分析纯（广州大华试剂公司），其他化学试剂均为分析纯。半边旗植物采收于广东湛江郊区，经广东海洋大学杨燕君副教授鉴定为半边旗。

　　2  方法与结果

　　2.1  半边旗总黄酮的测定

　　2.1.1  标准曲线绘制参照［5］，采用紫外分光光度计法并适当调整。精密称定干燥至恒重的芦丁对照品2 mg，加适量甲醇溶解，定容到10 ml即得对照品储备液。精密吸取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml对照品储备液于50 ml容量瓶中，加甲醇至20 ml，加入5%亚硝酸钠溶液2 ml，摇匀，放置5 min，加入10%硝酸铝溶液2 ml，摇匀，放置6 min，加入新配制的5%氢氧化钠溶液20ml，用甲醇定容至50ml，用分光光度计于500 nm处测定吸光度。以浓度(C)与相应的吸光度(A)进行回归分析，得回归方程A=0.163 2C+0.056 4，r=0.997 6。

　　2.1.2  样品总黄酮的测定称取干燥半边旗粗粉10 g，加入含溶剂的圆底烧瓶中，按表1的实验设计进行回流提取，过滤，取滤液挥干溶剂，残留物用甲醇溶解，定容到50 ml，即得样品溶液，用分光光度计测定500 nm处的吸光度值，由标准曲线样品总黄酮溶出量。

　　2.2   半边旗总黄酮的提取工艺考察

　　2.2.1  筛选因素水平半边旗总黄酮采用醇提法。经预试验研究，提取过程中可能的影响因素包括溶剂用量（A）、乙醇浓度（B）、提取次数（C）以及提取时间（D）。以半边旗总黄酮溶出量为考核指标，按4因素3水平进行正交实验，因素水平见表1。表1  因素水平表（略）

　　2.2.2  正交实验设计及结果按 L9(43) 正交表对半边旗进行提取并测定总黄酮量。结果见表 2～3。表2   正交实验结果及分析（略）表3  最佳工艺验证实验（略）

　　由表 2 和表3分析结果可知，在半边旗总黄酮的提取工艺中，各因素对提取效果的影响程度依次为B>C>A>D，且因素B（乙醇浓度）和C（提取次数）的影响具有统计意义，因此应选B2和C2，确定最优水平组合为A3B2C2D3，即溶剂为12倍量的80% 乙醇回流提取 2次、2 h/次。

　　2.2.3  放大的提取工艺验证实验称取3份半边旗干燥粗粉各500 g，采用A3B2C2D3最佳工艺条件提取，按“
2.1.2”方法测定提取液总黄酮含量平均为1.68 mg/g生药。提取液减压蒸去溶剂，所得浸膏60℃真空干燥72 h，称重得22.9 g棕黑色固体，得此提取物中总黄酮质量分数为11%。

　　2.3  半边旗黄酮的精制半边旗黄酮的精制采用溶剂抽提法。称取上述粗黄酮适量，按重量比3∶2混入硅藻土，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯进行索氏抽提，分别抽提至无色，取醋酸乙酯溶液，减压蒸干得棕黄色固体即为精制的半边旗黄酮。

　　2.4  半边旗精制黄酮的测定采用峰面积归一化法。以木犀草素和芹菜素混合溶液为对照品，以半边旗精制黄酮为供试品，分别进样高效液相色谱。以供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试品出峰总面积的比值确定供试品中的黄酮含量。
   
　　色谱条件：色谱柱Diamonsil C18 (150 mm×4.6 mm，5 μｍ)；紫外检测波长283 nm；流动相为甲醇-水溶液，按照甲醇含量 0～100%梯度洗脱；流速0.2 ml/min；柱温为35℃。

　　对照品溶液的配制：精密称取木犀草素和芹菜素对照品各1mｇ，置10ｍl容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，即为对照品溶液。

　　供试品溶液制备：称取精制的半边旗黄酮约2 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，即为供试品溶液。

　　吸取上述溶液5 μl，分别进样高效液相色谱。色谱图见图1～2。经峰面积归一化法计算供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试品出峰总面积的比值，计算得供试品中已知黄酮含量占84.3%。

　　3  讨论

　　以总黄酮溶出量为考核指标，半边旗用乙醇提取有利于黄酮类化合物的溶出，提高溶剂乙醇的浓度，可加快半边旗中总黄酮的溶出速度，从而使溶出量增加。但溶剂乙醇浓度过高时，黄酮物质的溶出量下降，这可能是溶剂乙醇浓度增加，反而使植物细胞脱水、皱缩，不易于溶胀破裂及总黄酮的溶出。
   
　　结合正交设计得出优选的最佳因素水平为 12倍用量的80%乙醇溶剂回流提取 2次，2 h/次。正交统计结果表明，提取时间因素的水平对总黄酮含量影响最小，从节能、考虑，样品的提取工艺最终采用每次提取 1.5 h 为佳。
   
　　采用最佳工艺条件放大提取半边旗，所得提取物中总黄酮溶出量达1.68 mg/g生药，总黄酮的质量分数占11%。进一步的研究表明该提取物中还含有脂溶性色素及萜类物质，其质量分数分别占5%和78%。
   
　　半边旗黄酮物质主要是木犀草素、芹菜素及其结合的糖苷［6］，精制后的半边旗黄酮成分含量占84.3%，达到新药开发的要求。有关药理及临床实验的结果表明木犀草素在体内具有抗菌、抗病毒及降低血脂和胆固醇的作用［7］，芹菜素具有抗炎、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物学活性［8］。因此开展半边旗黄酮的研究，为从该植物中开发新型中药提供了依据，有利于天然植物资源的综合利用。

【】
  　　［1］谢宗万.全国中草药名鉴［M］.北京：人民卫生出版社, 1996：53.

　　［2］Maurakami T, Tanaka N. Occurrence, structure and taxonomic applications of ferm constituents［J］. Prog Chem Organic Nat Prod, 1988, 54：1.

　　［3］张晓, 崔燎，田中信寿 ，等. 半边旗有效成分及抗肿瘤活性研究［J］.药学杂志，1997，32（1）：37.

　　［4］Li JH, Cui L. Effects of antitum or compounds is isolated from Pteris semipinnata L on DNA topoisomerases and cell cycle of HL-60 cells［J］. Acta Phamacol Sin, 1999,20(6)：541.

　　［5］傅玉萍，苟占平，胡菊英，等. 分光光度法测定不同时期半边旗总黄酮含量［J］.时珍国医国药，2001，12（12）：1080.

　　［6］吕应年，吴科锋，梁念慈，等. 高效液相色谱法测定半边旗中木犀草素的含量［J］.时珍国医国药，2007， 18（1）：102.

　　［7］汪丽燕,韩传环,王 萍.木犀草素对冠脉血流动力的实验研究［J］.中国药报,1992,8(5):388.

　　［8］孙斌. 芹菜素的药理作用研究进展［J］.中药材，2004， 27（7）：531.