多指标综合优选葛根溶剂提取条件
作者：宋文同，鲁立强，周云云，彭超，邢英，汤志勇
【摘要】 目的 建立溶剂提取葛根的最佳条件。方法采用高效液相色谱法和原子荧光光谱法测定葛根提取液中葛根素和铅、汞元素的含量，以葛根素和铅、汞元素的含量为评价指标，对影响溶剂回流提取葛根有效成分的条件进行优化。结果溶剂为80%乙醇；温度100℃；溶剂体积35 ml；提取时间及次数为3。结论该提取法使葛根单位有效成分中铅、汞元素的含量大为减少，并符合国标规定的限量要求。
【关键词】 葛根；葛根素；铅；汞；溶剂提取
Abstract：ObjectiveTo establish the optimum solvent extraction concentrations of Pueraria lobata. Methods The conditions of solvent extracting active ingredient from pueraria lobata were optimized，and evaluating indIcators were contents of puerarin,lead and mercury, which were determined by high performance liquid chromatography and atomic fluorescence spectrometry. ResultsThe optimum condition was extracting pueraria lobata three times for three hours with 35 ml 80%ethanol as solvent at 100℃. ConclusionContents of lead and mercury in active ingredient reduced greatly, and in line with limited demand of national standard.
Key words:Pueraria lobata； Puerarin； Lead； Mercury； Solvent extraction
葛根为豆科植物野葛或粉葛的块根，有山人参之美称，其主要有效成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物。葛根为常用中药，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的功效，多用于外感发热、头痛、项强、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻和高血压等症。目前其成品制剂主要有葛根素注射液、葛根黄酮片、愈风宁心片等，用于治疗高血压病、心绞痛和突发性耳聋等疾病均有显著疗效［1，2］。
关于葛根中提取葛根黄酮和葛根素的研究报道较多［3～6］。目前国内应用的中药提取方法，多以一种或几种有效成分含量作为提取条件的评价指标，而忽视了提取过程对中药材中重金属元素的控制。本文以葛根中有效成分葛根素的含量（因色谱峰面积A与含量成正比，故以A代表葛根素含量）和有毒元素铅、汞的含量（Cpb，CHg）为评价指标，探讨了在提取过程中降低葛根提取物中重金属元素含量的溶剂提取条件，使葛根提取物达到更高的质量标准。
1 器材与方法
1.1 仪器与材料
PE200/785A型高效液相色谱仪，785 A紫外可见分光光度计，美国PerkinElmer公司；AF-610A型蒸气发生-原子荧光光谱仪（北京瑞利分析仪器公司），铅/汞空心阴极灯（北京朝阳天宫电器厂）；分析天平；微孔溶剂过滤器；离心机；球形冷凝管；三口烧瓶；水浴锅；高压聚四氟乙烯消解罐；烘箱。
葛粉（过80目）；葛根素标准物质（药品生物制品检定所）；铅/汞储备液（1 mg·ml-1），使用时逐级稀释；硼氢化钾溶液（30 g·L-1/0.2 g·L-1）；100 g·L-1铁氰化钾－20 g·L-1草酸混合溶液；盐酸（2%）；硝酸（5%）；过氧化氢（30%）；试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
1.2 色谱条件［7］
色谱柱为Supelco-C18柱(5 μm，150 mm×4.6 mm，USA)；流速：0.7 ml·min-1；流动相：甲醇∶水（V∶V）=30∶70；检测波长250 nm；进样量10 μl。
1.3 原子荧光条件
1.3.1 铅的原子荧光条件负高压250 V；灯电流80 mA；辅助阴极灯电流30 mA；载气流量600 ml·min-1；原子化器高度7 mm；原子化器温度为室温；读数时间20 s；延迟时间2 s；测定方式：标准曲线测量；积分方式以峰面积计。
1.3.2 汞的原子荧光条件负高压270 V；灯电流40 mA；载气流量600 ml·min-1；原子化器高度7 mm；原子化器温度为低温；读数时间21 s；延迟时间3 s；测定方式为标准曲线测量；积分方式以峰面积计。
1.4 方法
准确称取粉末2 g于250 ml圆底烧瓶中，加入35 ml 80%乙醇，置于100℃水浴中回流提取1 h，冷却后经离心机（3 000 r/min）离心30 min，再按照同样的条件提取2次，合并3次滤液，经0.45 μm微孔滤膜过滤至100 ml容量瓶中，以乙醇溶液定容，摇匀。按照“1.2”项下色谱条件，对标准样品溶液和样品溶液进行HPLC测定，葛根素的含量。然后消解样品溶液，按照“1.3”项下原子荧光条件，进行AFS测定，计算铅、汞元素的含量，实验中所采用的AFS方法已通过标准物质茶叶(GBW10016)进行了验证，实验结果与推荐值一致。同时做空白实验。
2 结果
2.1 提取剂浓度的选择考虑到食用安全性的问题，本实验以乙醇为提取剂。以不同浓度的乙醇提取葛根，连续提取2 h，测定提取液中葛根素和铅、汞元素的含量。由表1可知，随提取剂中乙醇含量的提高，A/CPb一直逐渐增加，而A/CHg则先增加后减少，在60%时达到最高。考虑到国标规定的限量指标：Hg≤0.2 mg·kg-1，Pb≤5.0 mg·kg-1［8］，只有70%和80%的乙醇符合要求，其它均不同程度超标。本实验同时考虑了A/CPb与A/CHg的大小，即：单位有效成分中铅、汞元素含量的多少，由于（80% A/CPb）∶（70% A/Cpb）=1.43大于（70% A/CHg）∶（80% A/CHg）=1.09，最终选定提取剂浓度为80%乙醇。表1 提取剂浓度的影响数据（略）
2.2 提取温度的选择以80%乙醇为提取剂在不同的温度下提取葛根，测定提取液中葛根素和铅、汞元素的含量，由表2可知，其铅、汞元素的含量均低于国标规定的限量指标。随着温度的升高，A/CPb和A/CHg一直逐渐增加，在100℃时，A/CPb和A/CHg都为最大值。所以，本实验选择提取温度为100℃。表2 提取温度的影响数据表（略）
2.3 提取剂体积的选择使用80%乙醇溶液在100℃温度下提取葛根时，提取剂用量对提取液中葛根素和铅、汞元素含量的影响比较明显，由表3可知，其铅、汞元素的含量均低于国标规定的限量指标。随提取剂的增加，A/CPb的总趋势是逐渐升高，趋于平缓；而A/CHg则是逐渐降低，趋于平缓。虽然提取剂为15 ml时，A/CHg最大，但其A/CPb较小，不予考虑。从总体上看，只有提取剂为35和40 ml时，A/CPb与A/CHg均较大，由于（40 ml A/CPb）：（35 ml A/CPb）=1.05小于（35 ml A/CHg）：（40 ml A/CHg）=1.11，最终选定提取剂体积为35 ml，即液固相比为17.5∶1。表3 提取液体积的影响数据表（略）
2.4 提取时间及次数的选择以35 ml，80%的乙醇溶液在100℃温度下，用新溶剂提取葛根1次/h，即：1 h提取1次，2 h提取2次，以此类推，其铅、汞元素的含量均低于国标规定的限量指标。表4表明，随提取时间及次数的增加，A/CPb的趋势是先升高，后降低，在提取3 h后达到最大值；A/CHg也是先升高，后降低，在提取2 h后达到最大值。从总体上看，只有提取时间为2和3 h时，A/CPb与A/CHg均较大，由于（3 h A/CPb）：（2 h A/CPb）=1.04大于（2 h A/CHg）：（3h A/CHg）=1.03，最终选定为提取3次。表4 提取时间及次数的影响数据（略）
2.5 实际样品的定量分析取一定量的葛根素标准品配成标准储备液，将储备液逐级稀释至12.50，25.00，50.00，100.00 μg/ml按照“1.2”色谱条件进行测定。以峰面积（A）为纵坐标，标准品浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。葛根素在12.50～100.00 μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为：A=42246C-68 028 (r = 0.998 6)。
按上述实验方法制备3个平行样品溶液，在“1.2”项下色谱条件下，测定葛根样品中的葛根素含量；测定葛根素后，消解样品溶液，在“1.3”项下原子荧光条件下测定样品中的铅和汞。结果见表5。表5 葛根样品的分析结果（略）
3 结论
以葛根中葛根素和铅、汞元素的含量为指标，优选了溶剂回流提取的工艺条件，既确保了有效成分的较高含量；同时又尽量降低了有毒元素的含量，使单位有效成分中的铅、汞元素的含量大大减少，并符合国标规定的限量要求，优化工艺条件更为合理，较好地保证了制剂的质量，将有助于中药质量控制提取过程的标准化。
【】
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