北美刺人参指纹图谱及与东北刺人参化学成分比较研究
作者：赵月然，康廷国，窦德强，张放，王首千
【摘要】 目的 研究北美刺人参(Oplopanax horridus，OH)的HPLC指纹图谱，为评价及有效控制药材质量提供可靠方法。方法以紫丁香苷为对照品建立了O.horridus茎皮的HPLC指纹图谱，色谱条件为：色谱柱Kromasil C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm)，预柱Zorbax（12.5 mm×4.6 mm,5 μm）流动相为乙腈-0.05% 磷酸水溶液梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，柱温为 35℃，检测波长210 nm。对11批茎皮药材进行了相似度分析,并同东北刺人参(O. elatus Nakai，OE)茎皮指纹图谱进行了比较，采用系统聚类分析方法处理数据。结果相同种类药材的相似度较高，大于0.9,采用聚类分析可以聚为一类。结论指纹图谱可用于刺人参药材不同种类的鉴别。
【关键词】 北美刺人参； 东北刺人参； 指纹图谱； 聚类分析
AbstractObjectiveTo study on the HPLC fingerprints of Oplopanax horridus for offering a method on the quality control and assessment. MethodsSyringenin was used as reference substance to establish HPLC fingerprints of stem bark of O. horridus. Separations and determinations were carried out by linear gradient elution under following conditions: Kromasil C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm)，pre-column Zorbax(12.5 mm×4.6 mm,5 μm), acetonitrile- 0.05% phosphoric acid solution as mobile phase, detection wavelength of UV at 210nm, flow-rate of 1.0 ml/min, column temperature of 35℃. Similarity calculation software was used to evaluate the whole HPLC spectrums of 11 samples of OH stem bark. Furthermore, it was compared with fingerprint of O. elatus Nakai stem bark and clustering analysis was applied for data analysis. ResultsThe similarity of HPLC fingerprint was more than 0.9 among the same types of materials.ConclusionHPLC fingerprint can be used for differentiating sources of samples.
Key wordsO. horridus; O. elatus Nakai; Fingerprint; Clustering analysis
北美刺人参Devil's club 〔Oplopanax horridus(Sm.)Torr.&A.Gray ex.Miq., Araliaceae〕为五加科刺参属(Oplopanax Miq．)落叶灌木。主要分布在阿拉斯加及不列颠哥伦比亚［1］。北美刺人参的茎皮及根是当地的传统药用植物，可以用于各种疾病, 包括关节炎、感冒、发热以及糖尿病等［2］。本文对北美刺人参的茎皮的指纹图谱进行了系统的研究，并对比了北美刺人参茎皮与东北刺人参茎皮的化学成分，为进一步开发刺人参的药用价值提供科学基础。
1 仪器与材料
Agilent 1100型高效液相色谱仪：四元泵；在线脱气机；DAD检测器；柱温箱；HP Chemstation色谱工作站。Bp210S分析天平（德国Sartorius公司）。乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸为分析纯，水为三纯水（Millipore 公司）。紫丁香苷（纯度98%）为从北美刺人参自行提取，纯化。北美刺人参11批茎皮和1批根皮均采自美国Homer AK, 由美国阿拉斯加植物资源中心（Alaska Plant Material Center，Butte, Alaska，USA）主任David Smith和Stoney J. Wright鉴定。东北刺人参1批茎皮采自本溪，由辽宁中医药大学王冰教授鉴定。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，预柱Zorbax(12.5 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈-0.5%磷酸水溶液梯度洗脱，运行时间为60 min，梯度洗脱的程序以乙腈含量随时间的变化（体积比）：0～11 min，10%～20%乙腈，11～20 min，20%～32%乙腈，20～30 min，32%～60%乙腈，30～60 min，60%～86%乙腈；检测波长210 nm；流速1 ml/min；进样量10 μl；柱温35℃；进样前以流动相梯度初始条件平衡15 min。
2.2 对照品溶液的制备精密称取紫丁香苷对照品2 mg，甲醇溶解，制成100 μg/ml对照品溶液，放于4℃ 冰箱中避光保存，备用。
2.3 供试品溶液的制备取干燥刺人参样品（过40目筛）1 g，精密称定，加入甲醇50 ml，密塞称重后超声提取30 min，放冷，补重，摇匀，提取液经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，弃去初滤液取续滤液备用。
2.4 方法学考察
2.4.1 稳定性考察按照上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，分别在0，2，6，12，24 h进样，测得各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3%。结果表明样品溶液在24 h内稳定。
2.4.2 精密度考察按照上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，连续进样5次，考察仪器的精密度，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3%。结果表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性考察按照上述供试品溶液的制备方法制备5份样品溶液，测得各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3%。表明实验方法重复性良好。
2.5 样品分析
2.5.1 指纹图谱的测定 将11批北美刺人参茎皮样品溶液进行高效液相色谱HPLC-DAD测定，记录色谱图，如图1。其中标■处峰为对照品峰。
2.5.2 相似度分析采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”进行数据的处理，对不同批次的药材成分的指纹图谱进行相似度评价。结果表明，北美刺人参茎皮样品1～11号有24个共有峰，其中10个为主要特征峰，相似度分别为0.993, 0.972, 0.988, 0.997,0.993,0.997,0.998,0.974,0.937,0.957,0.997，相似度较高。
2.5.3 两种刺人参化学成分比较以OH样品S1与OE样品S13指纹图谱进行比较。见图2～3。其中4 s处峰为对照品峰。东北刺人参与北美刺人参的茎皮差别在于：东北刺人参缺少峰2，峰13，峰15，峰17；东北刺人参峰18，19，22相对峰面积在分别为89.4, 142.0, 1.86。而11批北美刺人参的相对峰面积分别小于20.0, 11.1, 0.85。11批北美刺人参峰14相对峰面积均大于6.8,东北刺人参峰14相对峰面积为1.69。
2.5.4 聚类分析聚类分析就是采用定量数学方法，根据一组样品的多个观测指标，具体找出一些能够度量样品之间相似程度的统计量，以这些统计量为划分类型的依据。［3］在11批次北美刺人参指纹图谱相似性评价的基础上，采用SPSS11.0统计软件对这11批药材进行聚类分析，并对北美刺人参根皮（12号样品）和东北刺人参茎皮（13号样品）同时进行分析，结果见图4。在系统聚类分析之前，为消除由于数据变换的幅度和范围以及数据分布的非正态性对聚类结果的影响，对原始数据进行了变换。变换数据如下表1。采用欧氏距离来描述样品之间的距离，利用离差平方和法来类与类之间的距离。表1 聚类分析数据（略）
3 讨论
本实验主要考察了甲醇，60%甲醇，60%乙醇，95%乙醇，丙酮作为提取的溶剂，结果以甲醇为提取溶剂，峰数较多，峰形好。提取方法主要考察超声提取，热回流，索氏提取，结果以超声提取效果最好。超声提取时间分别确定为15，30，45，60 min，结果以30 min最为合适。
洗脱条件的选择是在［1］基础上分别采用甲醇-水，乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.5%磷酸水、乙腈-0.5%磷酸水等不同的洗脱系统进行梯度洗脱。结果表明,以乙腈-0.5%磷酸水为流动相。检测波长采用DAD检测器，对190～400 nm扫描的各波长下的色谱图进行分析比较,选定210 nm为检测波长。所得图谱在此波长下记录的色谱图基线平稳,色谱峰数目较多。
聚类分析的数据处理是相对于对照品附近的5号峰面积进行数据处理，因为此峰的峰形好，含量高，又是对照品附近峰，数据结果可靠。
北美刺人参(OH)11批药材相似度均大于0.9，说明药材的化学成分和含量无明显差异。相似度分析的结果与聚类分析的结果基本一致。样品S12为OH根皮，其特征峰的个数与OH茎皮一致，但由于含量的不同，与对照谱图的相似度为0.74,在聚类分析中单独聚为一类，说明不同药用部位有一定的化学成分含量的差异性。
聚类分析结果显示东北刺人参(OE)的茎皮S13另为一类，两种种类的刺人参茎皮化学成分有一定的差异。化学成分对比说明主要差异在于峰14，18，19，22的相对含量。
【参考文献】
［1］Joseph Tai, Susan Cheung, Stefanie Cheah, Edwin Chan,David Hasman. In vitro anti- pro-liferative and antioxidant studies on Devil's Club Oplopanax horridus［J］. Ethnopharma- cology .2006, 108(2)：228.
［2］Trevor C.Lantz,Kristina Swerhun,Nancy J.Turner. Devil's Club (Oplopanax horridus)：An Enthnobotanical Review［J］. American Botanical Council，2004,62：33.
［3］章文波，陈红艳.实用数据统计分析及SPSS12.0应用［M］.北京：人民邮电出版社，2006.
