鳖甲复方针剂对Con A在Balb/c雄性小鼠中诱导肝纤维化的预防和治疗作用初探
作者：罗川，陈竹平，陈浩，张春笋，杨志荣，孙群
【摘要】 目的 探讨鳖甲复方中药针剂对Con A (concanavalin A)在Balb/c雄性小鼠中诱导肝纤维化的预防和作用。方法采用Con A诱导肝纤维化，造模期间及造模成功后均用复方中药针剂干预药剂组，比较组间各项血液生化指标和肝脏组织学方面的差异，以探讨针剂对肝纤维化的预防和治疗作用。结果复方针剂以3.3 ml/kg和6.6 ml/kg的剂量皮下注射均能显著降低血清中丙氨酸氨基转氨酶（ALT ）(P< 0.05)、门冬氨酸转氨酶（AST ）(P< 0.05)、球蛋白（G） (P<0.01)，升高A/G (P< 0.01)，透明质酸（HA）则在治疗过程中呈下降趋势。肝组织病理观察结果显示复方针剂能缓解肝纤维化的发生和，并可加快降解增生的纤维组织。结论鳖甲复方针剂对Con A在Balb/c雄性小鼠中诱导肝纤维化有一定预防和治疗作用。
【关键词】 肝纤维化；Con A；鳖甲复方针剂；血液生化指标；肝组织病理
Abstract:ObjectiveTo study the protective and therapeutic effects of the extract of Retinervus luffae fructus and Carapax trionyei on Con A-induced hepatic fibrosis in Balb/c rats.MethodsThe hepatic fibrosis in rats was first induced by intravenous injection of concanavalin A (Con A), the treatment in both protective and therapeutic stage was performed by subcutaneous injection of the extract. Albumin (A), globin (G), the ratio of albumin to globin (A/G), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and hyaluronidase (HA), as well as the pathological change of liver were measured in each group.ResultsIt was shown that the treatment at both low dosage of 3.3 ml/kg and high dosage of 6.6 ml/kg could significantly decreased ALT (P< 0.05), AST (P< 0.05), and G (P< 0.01), but increased A/G (P< 0.01), also HA showed the trend of decrease during the therapeutic period. The pathological changes of liver were also improved in the treatment group.ConclusionIt implies that the extract of Retinervus luffae fructus and Carapax trionyei is beneficial for the prevention and treatment of hepatic fibrosis in Balb/c rats.
Key words:Hepatic fibrosis; Concanavalin A; Retinervus luffae fructus; Carapax trionyei; Biochemical indexes of blood; Pathological changes in liver
肝炎是我国目前最突出的公共卫生问题之一。2005年病毒性肝炎首次与艾滋病、肺结核、血吸虫病并列，成为危害最严重的四大传染病之一。肝纤维化是慢性病毒性肝病向肝硬化发展的主要病理变化,是各种慢性肝病发展至肝硬化的中间必经阶段，也是肝硬化之前最后一个逆转的良机。因此,能否阻断肝纤维化的发生和发展，是治疗慢性病毒性肝病的关键所在。
Con A (concanavalin A)是从刀豆中提取的一种对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素 ［1～3］，其诱导的肝损害是T细胞具有依赖性的，与人类病毒性肝炎和自身免疫性肝病的病理过程非常相似。这种免疫性肝损伤模型是一个对人类病毒性肝炎和自身免疫性肝病进行抗肝损伤药物筛选的理想模型［4～8］。
鳖甲来源为鳖科动物中华鳖(Trionyx sinensis Wiegmann) 的背甲［9］，具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸等功能。丝瓜络(Retinervus luffae fructus,RLF)性味甘凉，归肝胃肺经，甘而平，有祛风通络，引血清热之功。据验方经反复试制，我们将丝瓜络、炙鳖甲经特殊工艺浓缩而成鳖甲复方针剂，并将其使用于Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤模型中，以期寻求作用温和、毒副作用相对较小、价格低廉的有效抗肝纤维化的中成药。
1 器材与方法
1.1 动物与分组
SPF级Balb/c雄性小鼠48只，8周龄，体重(20±2)g，购于四川省医学院医学实验动物中心。实验分为预防和治疗两个阶段。预防阶段，将健康小鼠随机分为4组：模型组24只，阴性对照组、大剂量组、小剂量组各8只。治疗阶段，将预防阶段模型组抽样后剩余的肝纤维化模型小鼠随机分为阴性对照组和药物治疗组，每组各8只。
1.2 试剂与药物
Con A 规格为25 mg/支，购自Sigma 公司。实验时溶于医用生理盐水配成2.5 mg/ml 的溶液。白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)测定试剂盒由北京中生北控生物科技股份有限公司提供；丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、门冬氨酸氨基转氨酶(AST)由南京建成生物工程研究所提供；透明质酸(HA)测定试剂盒，由上海森雄科技实业有限公司提供。由特殊工艺加工而成的丝瓜络、炙鳖甲复方针剂。
1.3 仪器
680酶标仪；JAUAS离心机；DK-98-1恒温水浴锅；UV-2450分光光度计。
1.4 方法
预防阶段，阴性对照组小鼠按12.5 mg/ kg的剂量尾静脉注射生理盐水，其余各组等剂量尾静脉注射Con A溶液。每周1次，持续9周。同时，鳖甲复方针剂按大（6.6 ml/kg）、小（3.3 ml/kg）剂量组皮下注射给药。阴性对照组和模型组则按6.6 ml/kg的剂量皮下注射生理盐水，1次/3 d，持续9周。9周后抽样6只模型组小鼠，摘除眼球取血，室温放置30 min后以4 000 r/min离心10 min，取血清测定各指标，观察肝脏外表，切取肝大叶，10%福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜下观察肝组织病变化。
确认造模成功后，立即以同样药物处理阴性对照、大、小剂量各组小鼠。治疗阶段，阴性对照组小鼠按6.6 ml/kg的剂量皮下注射生理盐水，药物治疗组小鼠按6.6 ml/kg的剂量皮下注射鳖甲复方针剂，持续31 d。在此期间每周每组抽样6只小鼠做毛细管穿刺眼眶静脉丛取血，制备血清，测定各项指标，动态观测小鼠的治疗情况。
1.5 血清指标预防阶段检测了ALT，AST，TP，Alb 4个血清学指标，治疗阶段引入了敏感度高的HA［10］，检测指标为ALT，Alb，HA。各项指标的测定均按照说明书操作。
1.6 统计分析
采用statistica 6.0处理数据，结果以±s表示，组间比较用t检验，P< 0.05为显著性差异，P< 0.01为极显著性差异。
2 结果
2.1 复方针剂对肝纤维化的预防作用
2.1.1 造模预防阶段进行到4周以后，模型组与阴性对照组相比明显出现了食欲不振，体毛凌乱，毛色灰暗，反应迟钝等现象。预防阶段结束后取出肝脏肉眼观察也可发现模型组小鼠肝脏色泽暗淡,边缘凹凸不平。血清检测结果(表1)显示模型组ALT，AST，HA、G较阴性对照组皆极显著偏高 (P< 0.01)，A/G极显著降低 (P< 0.01)，这说明肝纤维化模型的构建是成功的。但是，血清检测中白蛋白这一项模型组与阴性对照组相比并没有出现预期的显著性差异，估计是因为白蛋白的半衰期长达19 d［11］，虽然模型组小鼠在肝损伤后减少了白蛋白的合成，肝损伤之前合成的白蛋白并没有及时地分解掉，造成了检测结果中模型组的暂时性假偏高。值得一提的是，药剂组的白蛋白合成量与模型组、阴性对照组相比偏高，其中小剂量组产生了显著性偏高(P<0.05)。这个现象说明复合针剂可以提高肝脏白蛋白的合成能力，可能具有增强机体免疫的功效。
2.1.2 血液生化指标与模型组相比，小剂量组除能极显著降低G (P< 0.05)之外,还能显著提高G（P< 0.01）和显著降低ALT，AST (P< 0.05)，但是大部分指标都与阴性对照组有显著性差异(A，ALT，AST，P< 0.05)。而大剂量组则能显著降低G，ALT，AST(P< 0.01)，显著提高A/G(P< 0.01)，而且各项指标都非常接近阴性对照组（P > 0.05）。与小剂量组相比,大剂量组显著降低ALT，AST(P< 0.05)，（见表1）。说明此针剂对肝硬化具有一定的保肝和抗肝纤维化作用,且药效具有剂量依赖性。表1 复方针剂对小鼠肝功能指标的影响(略)
2.1.3 肝脏病理模型组小鼠肝细胞严重水肿，大量肝细胞坏死，脂肪变性，汇管区内炎细胞浸润严重，局部区域出现明显的纤维增生 (图1) 。与模型组相比，大剂量组细胞坏死，炎细胞浸润，纤维增生的情况已经基本消失，细胞水肿，脂肪变性，胞浆凝集的病变程度也得到极大的缓解。小剂量组虽然也在一定程度上减轻了各种病变，但是其效果远远比不上大剂量组(见表2)。这就说明复合针剂可以有效地保护肝细胞, 防止肝细胞的变性坏死，从而阻断纤维增生的发生和，且该作用与药物有剂量相关性。肝脏读片及评分标准均由四川大学分析检测中心第五检测室（华西公共卫生学院病理教研室）执行，除纤维增生计为0，1，2，3，4分5个等级外，其余指标均计0，1，2，3分4个等级。表2 各组小鼠肝脏切片评分情况（略）
肝细胞水肿数目在同一切片3个不同视野中平均数量小于10%计1分，10%～15%计2分，15%～20%计3分；同法可得脂肪变性细胞数量平均小于25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分；胞浆凝固细胞数量平均小于5%计1分，5%～10%计2分，10%～20%计3分；肝细胞坏死细胞数量平均小于5%计1分，5%～10%计2分，10%～20%计3分；纤维增生为可见增生计1分，明显可见增生计2分，视野中未形成全部假小叶的计3分，整个视野全部形成假小叶的计4分
2.2 阶段
2.2.1 肝功能指标在治疗的一个月内对两组小鼠作了4次血样抽查。其间引入灵敏度高、能及时反映肝脏纤维化治愈情况的指标HA［14］。结果显示，去除病因后,阴性对照组的ALT，HA的发展趋势是降低的，是良性发展的。这说明小鼠有一定的自愈能力。但即便如此,与同一时期阴性对照组相比，药物治疗组依然体现了它在愈合程度方面的显著差异(见表3)。而且，ALT，HA在经过31 d的治疗后都基本接近阴性对照组。这说明剂量为6.6 ml/kg的复合针剂对Con A诱导的肝损伤是有一定治疗效果的。表3 复方针剂对小鼠肝功指标的影响(略)
2.2.2 肝脏病理光镜观察结果(图2)显示，阴性对照组的肝细胞水肿和胞浆凝集的症状已经恶化，其它症状有缓解的趋势，但是其中脂肪变性和肝细胞坏死的症状的缓解情况比较轻微。这种现象说明，小鼠本身是有一定的自愈能力的。与阴性对照组相比，药物治疗组的所有肝脏病变指标都有不同程度的改善，而且部分指标已经趋于正常，其中以肝细胞坏死，肝脏炎性细胞浸润和纤维增生最为显著。这就说明，复合针剂对Con A诱导的免疫性肝损伤是有一定治疗效果的，它可以有效的清除坏死的肝细胞，加快降解增生的纤维组织，从而使病变的肝脏趋于正常。见表4。表4 小鼠肝脏切片评分情况（略）
3 讨论
肝纤维化是在各种致病因素作用下，沿着肝细胞变性坏死→炎症→纤维化这一途径反复发作而形成的［12］。在本次实验的预防阶段中，复方针剂起到了保护肝细胞，防止肝细胞的变性坏死的作用，而且大剂量（6.6 ml/kg）组表现得尤为明显。这一作用也在阻止炎细胞浸润和纤维组织增生方面得到了印证。ALT，AST在肝脏主要存在于肝细胞浆中，当肝组织遭到任何原因导致肝细胞损伤或通透性增加，ALT，AST便释放到血液中,使血清含量增高。本次实验中预防阶段模型组血清中ALT，AST的活性显著高于阴性对照组，支持这个理论，而且预防阶段大、小剂量组与模型组之间产生了显著差异。这就进一步说明了复方针剂在保护肝细胞、防止肝细胞的变性坏死方面的作用。
肝纤维化形成以后，存在着肝脏循环血量减少，肝内血流增加的情况［13］。本实验的治疗阶段选取肝纤维化模型小鼠进行治疗，治疗4周后治疗阶段药物治疗组血清中ALT，AST的活性与阴性对照组之间产生了显著性差异，对比两组的肝组织病理切片评分也可发现巨大差别。这就提示复方针剂可能具有减轻肝细胞变性坏死，使纤维化的肝脏加速修复的功效。肝纤维化时血中HA含量明显升高［14］，观察本实验治疗阶段中HA的动态变化情况和肝组织病理切片评分，发现阴性对照组HA在曲折下降，这说明这个模型的纤维化是可逆的，这可能是模型本身的原因，也有可能是造模时间或者Con A剂量的缘故。这个问题还有待进一步深入研究。但是，对比阴性对照组和药物治疗组也可发现两组之间在愈合程度方面的重大差别，药物治疗组是明显优于阴性对照组的。这就提示复方针剂可能减少胶原等基质成分的合成， 促进其分解，加速肝内新生纤维组织的重吸收，治疗已形成的肝纤维化。
研究证明，肝炎后肝硬化的病因主要是肝细胞持续损伤和再生，从而引起结缔组织形成过多，与免疫功能失调有关［15］。据《中药大辞典》等报道：丝瓜络含有多种多糖类物质，而多糖能提高机体的免疫功能，且对正常细胞没有毒副作用，对抗肿瘤的治疗疗效显著，并且还有保肝、降血糖、抗辐射等作用［16］。鳖甲含骨胶原、碳酸钙、磷酸钙、中华鳖多糖以及17种氨基酸,还含有十多种微量元素，可提高机体免疫力［17］，还具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸等功能。这正是中药复方抗肝纤维化多途径、多层次、多靶点的综合药作用的体现。
陈竹平为本实验提供鳖甲复方针剂，谨致谢意!
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