大蒜多糖组分A总多糖含量的分光光度法测定
作者：余薇，查文良，梁惠敏，吴基良，刘彤云
【摘要】 目的 对大蒜多糖组分A进行提取并测定其含量。方法采用0.5%草酸铵溶液提取、醇沉的方法分离纯化大蒜多糖组分A，以苯酚-硫酸显色法测定大蒜多糖组分A的含量。结果在2.0～15.0 μg/ml内，浓度与吸光度呈良好线性关系。回归方程：A=0.080 6C-0.021 9 (r=0.993 4，n＝10)，平均回收率为96.14％ ，RSD％为0.06（n＝5）。大蒜多糖组分A的平均糖含量为77.40% ，RSD％为3.74（n＝5）。结论方法简便，结果准确，为今后对大蒜多糖的药理作用以及其它组分进一步研究奠定良好的基础。
【关键词】 大蒜多糖组分A; Sevage法; 苯酚-硫酸法； 多糖
Abstract：ObjectiveThe polysaccharides A were extracted from garlic and the content was determined. MethodsPolysaccharides A was extracted and purified through 0.5% ammonium oxalate and ethanol precipitation, the content was determined by phenol-sulfuric acid under 485 nm. ResultsFrom the range of 2.0-15.0μɡ/ml, there was an excellent linear shape between the concentration and absorbency. The regression equation: A=0.0806C～0.0219,（r=0.9934，n＝10）.The average recovery was 96.14% with RSD=0.06% (n=5). The average polysaccharides content from garlic was 77.40%,RSD=3.74% (n=5). ConclusionThe method is simple and accurate.
Key words：Garlic polysaccharides A; Sevage; Phenol-sulfuric acid
大蒜为百合科葱属多年生草本植物，明代《本草纲目》记载大蒜有散痛肿、除风邪、杀毒气、祛风湿、疗毒癣、健脾胃、止霍乱、解瘟疫等功效［1］，可数十种疾病。大蒜多糖是大蒜的醇沉部分，具有大蒜多糖组分A，B和C成分，本科室通过大量实验研究发现大蒜多糖具有抗氧化、清除氧自由基、保护心肌的作用［2，3］。因此，大蒜多糖糖含量的测定是探讨其组效关系的重要前提。本文从大蒜中分离纯化出大蒜多糖组分A成分，通过紫外分光光度法测定样品中总多糖含量［4，5］，以期更好地控制多糖的质量。
1 器材
1.1 药材市售山东产大蒜。
1.2 试剂
葡萄糖标准品，上海化学试剂公司产品；苯酚，上海化学试剂公司产品；硫酸(分析纯)，上海化学试剂有限公司产品；95％ 乙醇；蒸馏水。
1.3 仪器
UV-754型紫外可见分光光度计；FA1104分析天平。
2 方法与结果
2.1 大蒜多糖组分A的分离纯化取新鲜大蒜去皮碾碎，无水乙醇浸泡脱脂，在沸水浴中用4～5倍0.5%草酸铵溶液提取8 h，滤液以冰醋酸调节pH值至4.5，乙醇醇析得大蒜多糖组分A 粗品，用Sevage法去蛋白，在55 ℃下干燥至恒重得大蒜多糖组分A 精制品，得率为12.94%。纯化后的大蒜多糖进行了紫外可见光谱段扫描，结果显示在260和280 nm 处无吸收，表明大蒜多糖组分A中无蛋白质成分，而在190 nm处有多糖的特异性吸收峰。 见图1。
2.2 试剂的配制
2.2.1 标准品溶液的制备
精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10.0 mg置100 ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，摇匀即得浓度为100 μg/ml的标准品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取55 ℃干燥至恒重的大蒜多糖组分A 10.0 mg置100 ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，摇匀即得浓度为100 μg/ml的多糖供试品液。
2.2.3 5%苯酚试剂的配制
取苯酚100 g，加铝片0．2 g和NaHCO3 0.1 g，蒸馏。收集180～182℃ 馏分，精密称取精制苯酚5.0 g溶解后转至100 ml容量瓶中定容，摇匀，得5%苯酚试剂。
2.3 检测波长的选择
精确量取80 μg/ml的葡萄糖溶液1.0 ml，样品溶液1.0 ml置干燥试管中，分别加入5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，然后加入浓H2SO4 5.0 ml摇匀，另以1.0 ml水作同上操作，作为空白液，于室温中放置5 min，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在波长200～800 nm之间扫描。结果供试品与标准品溶液在485 nm波长处均有最大吸收，而空白溶液在此波长处无干扰，故选用485 nm 为检测波长。见图2～3。
2.4 标准曲线的绘制
精密量取标准品溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml分别置11只试管中，各加蒸馏水至1.0 ml，再加1.0 ml 5％苯酚溶液，摇匀后再加入5.0 ml浓H2SO4，摇匀，室温放置5 min，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在485 nm处，以蒸馏水管作为空白对照，测定各浓度标准液的吸光度，以糖浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A=0.080 6C-0.0219 (r=0.993 4，n＝10) ，两者相关性较好。见图4。
2.5 换算因素的测定
精确量取供试品溶液2.0 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。按下式计算换算因素f＝2.007 8。f=W/C·D
W为大蒜多糖质量（μg），C为供试品溶液中葡萄糖的质量浓度（μg/ml），D为供试品溶液的稀释倍数。
2.6 精密度实验
随机取“标准曲线绘制”项中其中一支葡萄糖试管液，置于光度计中，反复测量该标准液的吸光度5次，结果RSD=0.21％。见表1。表1 精密度实验（略）
2.7 稳定性实验
精密量取50 μg/ml多糖样品1.0 ml ，按测定标准曲线同样的方法每隔20 min测定样品溶液吸光度，观察100 min内吸光度的变化情况，算得吸光度的RSD=0.13％，结果表明样品溶液在100 min内显色稳定。见表2。
2.8 重复性实验
精密称取同一批次大蒜多糖组分A 10 mg各5份，分别置于5个100 ml容量瓶中定容，精密量取100 μg/ml多糖样品溶液5.0 ml于10 ml容量瓶中，稀释成50 μg/ml的样品溶液，各取1.0ml于5支干燥试管中,按测定标准曲线同样的方法操作,在485.0 nm处分别测定其吸光度，算得其RSD=3.74％。表2 稳定性实验（略）
2.9 多糖含量的计算
精密称取多糖10.0 mg，用蒸馏水溶解后定容到100 ml，精密量取100 μg/ml多糖溶液5 ml至10 ml容量瓶中稀释至50 μg/ml的样品溶液。取样品液1.0 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度，算得平均糖含量为77.40%。见表3。表3 多糖含量的计算（略）
多糖含量(%)=(C·D·f)/W·100％
C为测得样品溶液中葡萄糖的浓度(μg/ml)；D为样品溶液的稀释倍数；f为换算因素；W为大蒜多糖质量(μg)。
2.10 回收率实验
精密量取样品溶液1.0 ml于试管中，加入与样品浓度相近的葡萄糖对照品溶液1.0 ml，按测定标准曲线同样的方法操作，算得样品的平均加样回收率为96.14％，RSD=0.06％,表明本方法准确度良好。
3 讨论
多糖广泛存在于界，是多种中草药的有效成分之一，具有多种生物活性，本文运用醇沉法从大蒜中提取大蒜多糖组分A,并运用苯酚—硫酸比色法对其含量进行了测定，苯酚—硫酸比色法为多糖含量测定的经典方法，本实验中该方法的原理是大蒜多糖在硫酸的作用下，先水解为单糖，单糖迅速脱水形成糖醛衍生物，糖醛衍生物再与苯酚缩合为有色化合物。该有色物质在485.0 nm处有最大吸收,可在该波长处进行测定算得大蒜多糖的含量。结果表明，本法简单，显色稳定，灵敏度高，重复性好,回收率较高。
本实验对大蒜多糖含量测定的各项指标均进行了详细考察,结果表明，上述提取及含量测定方法适用于大蒜多糖组分A, 测得多糖的含量为77.40％ ，糖含量较高，有较高的开发价值。
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［1］贾江滨,刘静,谭亚非.大蒜化学成分研究进展［J］.广东药学,1999,9(1):1．
［2］余薇, 吴基良,汪晖，等.大蒜多糖对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用［J］.药通报，2005，21(9):1104.
［3］郑敏,卢葵花,吴基良,等.大蒜多糖体外抗乙型肝炎病毒作用研究［J］.中药药理与临床，2005, 21(3): 29.
［4］张立,马琼,何永立,等. 灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖的含量测定［J］.中草药，2004,35(2):167．
［5］粱惠花.雷公藤多糖的提取和含量测定方法研究［J］.中国应用药学杂志，2004,21(1)：8
