蓖麻油甾醇组成及其对大鼠蜕膜细胞的影响
作者：张小雪 段双全 韩峰 高平 刘世贵
【摘要】 目的进一步探明蓖麻油中的抗生育物质成分。方法利用皂化和萃取,从蓖麻油中提取甾醇,用GC-MS分析蓖麻油甾醇成分；用MTT法检测蓖麻油甾醇对原代培养大鼠蜕膜细胞活力的影响。结果蓖麻油总甾醇的主要成分为γ-谷甾醇（43.02%）、豆甾醇（27.15%）、岩藻甾醇（11.43%）、麦角甾-5-稀-3 -醇（6.00%）和普罗布考（7.46%）。蓖麻油甾醇对细胞活力有抑制作用，其半抑制剂（IC50）剂量为：(88.45±3.196) μg/ml,r=+0.9549；抑制作用具有量-效关系。结论在蓖麻油甾醇的主要成分中，γ-谷甾醇（r-Sitosterol）可能是抑制原代培养大鼠蜕膜细胞活力的主要成分，而豆甾醇（stigmasterol）可能起协助的作用。
【关键词】 蓖麻油 甾醇 原代培养大鼠蜕膜细胞 气相色谱-质谱联用分析 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法
Abstract：ObjectiveTo assay the constituents of phytosterol of castorbean seed oil and the inhibition on the viability of primary cultured rat decidual stormal cells (DSC). MethodsThe methods of GC-MS analysis and MTT method were adopted, respectively. ResultsThe main constituents of phytosterol of castorbean seed oil were γ-Sitosterol (43.02%), Stigmasterol (27.15%), Fucosterol (11.43%), Probucol (7.46%) and Ergost-5-en-3-ol (6.00%); the phytosterol possessed inhibitory activity on the viability of primary cultured rat DSC in a dose dependent manner. The IC50 was （88.45±3.196）μg/ml, r= +0.954 9. Conclusion The γ-Sitosterol may act as the main contributor in the inhibition on the viability of DSC，and the Stigmasterol might act as an assistant.
Key words：Castorbean seed oil; Phytosterol; Primary cultured rat decidual stormal cells; GC-MS analysis; MTT method
蓖麻Ricinus communis L.为大戟科一年生或多年生草本植物，原产于非洲，我国各地均有栽培。蓖麻不仅是著名的油料作物，而且是重要的中药材。在我国，蓖麻籽具有消肿拔毒、泻下通滞、消除痈疽肿毒、导泻等［1］功能，临床上用蓖麻油炒鸡蛋进行催产已有多年的［2，3］；在一些非洲国家，妇女用蓖麻籽进行避孕［4］。有报道，蓖麻籽提取物具有抗雌鼠和雄鼠生育的作用［5～8］。本实验室秦晓娜蓖麻油抗小鼠生育实验表明，蓖麻油抗小鼠早孕的抑制率达80%以上，抗小鼠着床抑制率达100%［9］。我们在对蓖麻油抗鼠类生育作用机理的研究中，发现蓖麻油引起小鼠子宫内腔扩大，子宫壁和肌肉层明显变薄；肌纤维排列疏松、紊乱；子宫基质层变薄，其内腺体减少；黏膜上皮增厚。离体实验表明，蓖麻油对原代培育SD大鼠蜕膜细胞活力有抑制作用。然而，在蓖麻油中，是哪一种或哪几种物质起着抗生育作用还未见有文献报道。在许多植物油中，甾醇具有多方面生理功能。本实验通过皂化获得蓖麻油甾醇，用MTT法检测蓖麻油甾醇对大鼠蜕膜细胞活力的作用，用GC-MS检测甾醇的主要成分，以进一步探明蓖麻油中的抗生育物质成分。
1 器材与方法
1.1 材料和甾醇的提取受试蓖麻籽购自成都五块石中药市场。蓖麻油由本实验室提取，参照秦晓娜方法进行［9］，略有改动。小心去壳后，用粉碎机将蓖麻籽粉碎，加入95%乙醇，匀浆；在60℃水浴中提取96 h，10 000 r/min离心30 min(0℃)；弃沉淀，留上清，挥发除去乙醇得乙醇提取物。此提取物用乙醚在50℃条件下索式提取24 h，挥发除去乙醚后即得蓖麻油。
取60 g 蓖麻油，用600 ml KOH 乙醇溶液 (1 M) 皂化 1h (100℃)， 趁热加入600 ml ddH2O，冷却后用乙醚萃取4次，合并萃取液，用480 ml dd H2O 清洗，共清洗4次，直到萃取液为中性。挥发除去乙醚，用600 ml dd H2O 重悬未挥发部分，每次用1 200 ml乙醚重新萃取不皂化物，重复萃取4次以除去残余皂化物；挥发去除溶剂即得淡黄色半固体物质，即蓖麻油不皂化物（得率1.135%）。用丙酮萃取除去丙酮不溶物，挥去丙酮，用95%乙醇室温下清洗除去黄色油状物，得白色晶体，即蓖麻油总甾醇（得率0.470%）。
用于体外培养大鼠蜕膜细胞活力抑制实验的蓖麻油甾醇与吐温-80按1∶1在研钵内混匀，再滴加于生理盐水中，配制成10 mg/ml的处理母液；将母液磁力搅拌30 min，无菌过滤后4℃保存备用。同法配制吐温-80生理盐水溶液作为阴性对照，米非司酮为阳性对照。
1.2 仪器设备和试剂气相色谱- 质谱联用仪（QP 2010 型，日本，岛津）；手提式压力蒸气灭菌锅（申安医疗器械厂）；二氧化碳培养箱（311型, Thermo，USA），超净工作台（SW-CJ-2N 型，哈尔滨东联公司），Nikon 倒置显微镜（CHINAYS2-H型，日本）， 酶标仪 (680 型, Bio-Rad，USA )。胰蛋白酶、米非司酮、MTT和DMSO（Sigma 公司），青霉素（华北制药有限公司），庆大霉素（西南药液股份有限公司），DMEM/F12(1∶1)培养基 (Gibco，Invitrogen 公司)，小牛血清（成都哈里）。
1.3 大鼠蜕膜细胞的培养取妊娠15 d SD大鼠乙醚麻醉，去毛后断颈处死。75%酒精将大鼠整体消毒后放入超净台内，分别用碘酒、75%酒精消毒腹部皮肤和肌肉，迅速剪下子宫，放入盛有4℃ D-Hanks液无菌培养皿中洗去血污。剪开子宫，分离出胚胎后用无菌载玻片刮取子宫蜕膜组织，并将蜕膜组织放入无菌小瓶中剪碎。加入适当量0.25%胰蛋白酶液，37℃温浴30 min，然后加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养液停止消化。用带5号针头的注射器吸取单细胞液，1 000 r/min离心10 min；用含10%小牛血清DMEM/F12培养液重悬细胞，1 000 r/min离心10 min，留细胞沉淀，加入2 ml含10%小牛血清DMEM/F12培养液，细胞混匀计数。调整细胞浓度为5.0×105/ml，制成细胞接种液。在96孔培养板每个孔中种入200 μl细胞接种液，移入37℃，5%CO2培养箱。培养24 h换培养液1次，然后每48 h换培养液1次。
1.4 蓖麻油甾醇处理原代培养大鼠蜕膜细胞和MTT法检测细胞活力蜕膜细胞培养6 d后，每孔换入200 ml含不同浓度蓖麻油甾醇的培养液处理细胞24 h。 处理剂量分别为15.625，31.25，62.5，125和250 μg/ml。设相应剂量Tween-80为阴性对照，米非司酮（0，2.5，5，10和20μg/ml）为阳性对照。每个处理剂量设4个重复孔，实验重复3次。
MTT法检测原代培养大鼠蜕膜细胞活力：参照Carmichael方法［10］进行，略有改动。每孔加入20 μl MTT（2 mg/ml）后，将96孔培养板置37℃，5%CO2培养箱中培养4 h；吸出孔内培养液，每孔加入DMSO溶液150 μl，振荡10 min后，570 nm处检测细胞的OD值。
按下列公式蓖麻油甾醇对细胞活力的抑制结果：细胞活力抑制率(%)=［（对照组细胞OD值－处理组细胞OD值）/对照组细胞OD值］×100%。
半抑制浓度（IC50）为细胞生长抑制率达50%的蓖麻油甾醇处理液浓度。
1.5 统计学处理所有数据均用spss10.0软件进行分析，计算平均值与标准差，回归分析。
1.6 蓖麻油甾醇成分的GC-MS分析GC-MS色谱条件：色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯度氮气，体积流量1 ml/min；进样温度300℃；柱温285℃，每分钟升高5℃， 320℃保持30 min；电离方式EI＋；能量70ev；接口温度250℃；离子源温度200℃；检测电压350 v；进样量1 μl。各成分通过NIST05.LIB标准质谱图库进行计算机检索和相似性比较。面积归一法计算各组分相对含量。
2 结果
2.1 蓖麻油甾醇的GC-MS分析结果对蓖麻油甾醇进行GC-MS分析，所得9个峰中鉴定出7种成分（图1和表1）。 已鉴定的化学成分约占甾醇的77.78%，其主要成分为γ-谷甾醇（43.02%）、豆甾醇（27.15%）、岩藻甾醇（11.43%）、普罗布考（7.46%）和麦角甾-5-稀-3 -醇（6.00%）。 3种含量较多物质的MS图谱见图2。
2.2 蓖麻油甾醇对大鼠蜕膜细胞活力的抑制作用蓖麻油甾醇对大鼠蜕膜细胞活力有抑制作用，且抑制作用具有良好的量-效关系（图3）。根据线性回归方程Y = 0.206 4X + 31.743出其半抑制剂量（IC50）为（88.45±3.196）μg/ml，r=+0.9549；而阳性对照米非司酮的半抑制剂量（IC50）为（9.26±2.1）μg/ml，r=+0.935 7。表1 蓖麻油甾醇成分及其相对质量百分数 （略）
3 讨论
蜕膜在早孕的维持中具有重要的作用。胚胎在生长发育过程中，母体的营养物质主要通过蜕膜细胞直接进入胚胎。同时，蜕膜组织可能具有免疫屏障功能，且具有保护作用，既保护胎儿，也保护母体自身［11，12］。因此，一旦蜕膜发生变化，早孕的维持将受到严重的影响。
前人的研究表明，大多数食用植物油甾醇成分主要为菜籽甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和菜油甾醇。在本实验中，蓖麻油甾醇晶体经GC-MS分析表明，蓖麻油甾醇主要由γ-谷甾醇（γ-Sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、岩藻甾醇（Fucosterol）、普罗布考（Probucol）和麦角甾-5-稀-3 -醇（Ergost-5-en-3-ol）等成分组成。其中γ-谷甾醇（γ-Sitosterol）含量最高，达43.02%；豆甾醇（Stigmasterol）含量次之（27.15%）；岩藻甾醇（Fucosterol）、普罗布考（Probucol）和麦角甾-5-稀-3 -醇（Ergost-5-en-3-ol）等含量分别为：11.43%，7.46%和6.00%。γ-谷甾醇与β-谷甾醇互为异构体，在大多数可食用的植物油中很少有γ-谷甾醇成分的报道。关于植物甾醇功能的研究表明，γ-谷甾醇有细胞毒性作用［13］；豆甾醇是甾体激素和一些维生素合成的前体，具有表面活性剂的功能［14］；岩藻甾醇具有抗肿瘤和降低血脂的作用［15］；普罗布考作为一种抗氧化剂，能抑制内膜和平滑肌细胞增生［16］。本研究的蓖麻油甾醇对体外培养大鼠蜕膜细胞活力影响实验表明，蓖麻油甾醇晶体对体外培养大鼠蜕膜细胞活力有明显的抑制作用，而蓖麻油甾醇的主要成分是结构与β-谷甾醇（β-Sitosterol）结构十分相似的γ-谷甾醇（γ-Sitosterol）；有报道γ-谷甾醇对盐水虾（Artemia Salina）具有细胞毒作用［13］。根据已有的对植物油甾醇成分功能的研究报道、本实验中蓖麻油甾醇各成分的含量以及相关的细胞实验结果推测，γ-谷甾醇（γ-Sitosterol）可能是蓖麻油甾醇晶体中抑制离体培养大鼠蜕膜细胞活力的主要成分，而豆甾醇（Stigmasterol）可能起协助的作用。
有研究表明，组成植物甾醇晶体的各组分结构非常相似，仅仅在双键的数量和位置以及组成侧链的碳原子数量上有变化, 各组分物理性质非常相似以至于将各组分分离成单一成分十分困难［17，18］。因此对蓖麻油甾醇晶体的每一种成分影响蜕膜细胞活力进行检测、蓖麻油甾醇中“γ-谷甾醇（γ-Sitosterol）可能是晶体中抑制离体培养大鼠蜕膜细胞活力的主要成分，而豆甾醇（Stigmasterol）可能起协助的作用”这一推测是否正确、蓖麻油甾醇晶体的其它成分是否对蜕膜细胞的活力也有抑制作用等还有待进一步的实验研究。
本实验得到潘维高、陈丽同学的热情帮助，在此表示感谢！
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